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1ut — Wed, 12 May 2021 02:52:40 +0000

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Functional insight into Maelstrom in the germline piRNA pathway

1ut — Fri, 30 Apr 2021 07:21:05 +0000

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2628886/

Abstract

MAELのconserved residues(Glu-His-His-Cys-His-Cys, EHHCHC) は脊椎動物、ホヤ、昆虫、線虫、原生生物で見つかっている

Maelstrom (MAEL) plays a crucial role in a recently-discovered piRNA pathway; however its specific function remains unknown. Here a novel MAEL-specific domain characterized by a set of conserved residues (Glu-His-His-Cys-His-Cys, EHHCHC) was identified in a broad range of species including vertebrates, sea squirts, insects, nematodes, and protists.

硬骨魚類では失われている <- 卵? <- 硬骨魚類から進化した哺乳類で復活した？

It exhibits ancient lineage-specific expansions in several species, however, appears to be lost in all examined teleost fish species.

MAELドメインの機能は HMG, SR-25-like and HDAC_interactとの相互作用で明らかになりうる

Functional involvement of MAEL domains in DNA- and RNA-related processes was further revealed by its association with HMG, SR-25-like and HDAC_interact domains.

全てのMaelドメインが標準的なcanonical RNase H foldをとっていることから、RNase H foldを持つDnaQ-H 3'–5' ヌクレアーゼとの遠い類縁性が発見された。
原生生物のMAEL domainsはDEDHDドメインを保存していた。

A distant similarity to the DnaQ-H 3'–5' exonuclease family with the RNase H fold was discovered based on the evidence that all MAEL domains adopt the canonical RNase H fold; and several protist MAEL domains contain the conserved 3'–5' exonuclease active site residues (Asp-Glu-Asp-His-Asp, DEDHD).

この進化的な繋がりは、構造的研究と合わせて考えると、MAELドメインがpiRNA 生合成に関わる潜在的なnuclease activityまたはRNA-binding abilityを持っているかもしれないという仮設に繋がった。

This evolutionary link together with structural examinations leads to a hypothesis that MAEL domains may have a potential nuclease activity or RNA-binding ability that may be implicated in piRNA biogenesis.

祖先であるDnaQ-Hと子孫であるMAEL domainsの間で独特な２残基の移り変わりが観察されたことは、active site switchというタンパク質の進化的なモデルを示唆する。
active site switch: 「原生生物のMAELホモログは、3'–5' エキソヌクレアーぜとMAEL domainsの特徴を失っているので、進化の中間体である」 <- phase seperationは保持されてる？3'–5' エキソヌクレアーぜはphase seperationする物がある？

The observed transition of two sets of characteristic residues between the ancestral DnaQ-H and the descendent MAEL domains may suggest a new mode for protein function evolution called "active site switch", in which the protist MAEL homologues are the likely evolutionary intermediates due to harboring the specific characteristics of both 3'–5' exonuclease and MAEL domains.

Background

生殖細胞はnuage（germ plasm）という特有のorganelleにより異種間で特徴付けられてきた。
piRNAやrasiRNAsがトランスぽゾン抑制してる
VASA [11], MAEL [11], SPN-E [12,13], Oskar [14], Tudor domain proteins, Armitage [13], Krimper [11], Cutoff [16], Dead end [17] and Zucchini and Squash [18].のようなgerm plasmタンパク質がある.
トランスぽゾン抑制タンパクのノックアウトによるspindle-class gene phenotypes: 卵母細胞の極性消滅、Oskar, Gurken and BiocoidにおけるmRNA局在の崩壊、核小体期への進行の失敗

Germline cells among different species are characterized by the presence of a morphologically unique organelle called the germ plasm (also referred to as nuage, polar granules or mitochondrial cloud) [1,2]. This organelle has been considered the determinant of germline development. Very recently a germ plasm-specific small RNA pathway has been identified, in which a new type of small RNAs called PIWI-interacting RNAs (piRNAs) or repeat-associated small interfering RNAs (rasiRNAs) play a role in ensuring the genomic stability of germline cells by silencing certain endogenous genetic elements such as retrotransposons and repetitive sequences [3-8]. Different from short interfering RNAs (siRNAs) and microRNAs which are usually 21–22 nt long, piRNAs or rasiRNAs have longer nucleotide composition (26–31 nt) and 2'O-methyl modification in 3' end. Many germ plasm proteins are functionally important in piRNAs synthesis and function, including PIWI proteins (PIWI, Aubergine and AGO3) [4,9,10], VASA [11], MAEL [11], SPN-E [12,13], Oskar [14], Tudor domain proteins [15], Armitage [13], Krimper [11], Cutoff [16], Dead end [17] and Zucchini and Squash [18]. Their loss-of-function mutations commonly cause a huge reduction in the amount of piRNAs or rasiRNAs and an increase in transcript level of transposable elements in the germline cells [11,19,20] as well as the spindle-class gene phenotypes: failure in establishing anterior/posterior polarity in early oocytes, disrupted asymmetric subcellular mRNA localization of Oskar, Gurken and Biocoid, ectopic expression of Oskar and Gurken, failure to proceed to the karyosome stage [8,11,13,21].

PIWIはPAZ および PIWIドメインを含むので、single-stranded RNAの認識および配列特異的なtarget nucleotideのendonucleolytic分解をそれぞれ示す、
VASA, SPN-E, ArmitageはDEAD RNA helicase domainsを含むので、piRNA productionおよびretrotransposon silencingのためのhelicase activitiesを提供する
Zucchini and SquashはpiRNA maturationに関わるとされるヌクレアーゼ
Krimper and Tudor proteinsはmultiprotein RNA-induced silencing complex (RISC) や分解時のtargeting substrate RNA recognitionを助けるとされる
MAEL in piRNA pathway の役割は未知
MAELは最初にgenetic loss-of-function Drosophila mutantで見つかった。
生殖細胞でSPN-E, VASA, Aubergine, Tudor or Krimperの位置がMAELの場所を決める
MAELはDicer and Argonaute2の場所を決める
MAEL は germ plasm と the nucleus [21]の間を移動する.
MAEL と chromatin remodeling proteins SNF5/INI1 and SIN3Bは直接相互作用すると知られている <- 知らなかった
MAELはgerm plasm や piRNA pathwayをchromatin remodeling（トランスポゾンサイレンシング）と結びつける唯一のタンパク質である <- 知らなかった
homologous sequence miningやphylogenetic analysis、domain architecture、protein fold recognition, and structure modelingによりMAELの機能を確かめるのが目的。

The molecular functions of most germ plasm proteins in the piRNA pathway have been assigned based on domain examination, biochemical and genetic characterizations. For instance, PIWI proteins contain the PAZ and PIWI domains, which contribute to recognition of single-stranded RNA [22] and sequence-specific endonucleolytic cleavage of target nucleotide [23,24], respectively. VASA, SPN-E and Armitage share DEAD RNA helicase domains, which provide helicase activities for piRNA production or retrotransposon silencing [13,25]. Zucchini and Squash are putative nucleases, which are believed to be involved in piRNA maturation [18]. Other Dead end, Krimper and Tudor proteins, contain RNA binding domains RRM [26] or Tudor [27] which may facilitate the assembly of multiprotein RNA-induced silencing complex (RISC) and targeting substrate RNA recognition during cleavage. In contrast, although many studies including specific knockouts, protein interaction and cellular distribution experiments have been conducted, the definitive function of MAEL in piRNA pathway remains unknown. MAEL was initially identified in a genetic loss-of-function Drosophila mutant, whose germline cells exhibit incorrect posterior localizations of several transcripts (i.e., Gurken, Oskar and Bicoid) [12]. It is a germ plasm-specific protein with all spindle-class gene phenotypes [12,13,21,28] and directly involved in the piRNA pathway [11,29]. The correct location of either SPN-E, VASA, Aubergine, Tudor or Krimper in germ plasm determines the location of MAEL [11], which in turn delineates the location of Dicer and Argonaute2 [21]. MAEL can shuttle between germ plasm and the nucleus [21]. Direct interaction between MAEL and chromatin remodeling proteins SNF5/INI1 and SIN3B during heterochromatin formation has also been demonstrated [30]. Therefore, MAEL is the only known protein connecting germ plasm and piRNA pathway to chromatin remodeling, a process required for piRNA-initiated genome transposon silencing [31]. In the present study, we were motivated to understand the putative function of MAEL using combined bioinformatic strategies including extensive homologous sequence mining, phylogenetic analysis, domain architecture, protein fold recognition, and structure modeling.

Results

A conserved MAEL-specific domain and its unique lineage-specific evolutionary expansion and loss

ドメインのアノテーションはマウスのMAELタンパク質はN末端にHMG domainを含むことを示している。HMGは非ヒストン部位や転写調節因子で働くDNA-binding moduleである。
MAELのC末端についてはドメイン情報が得られなかった。
NCBI NR databaseに対して、PSI-BLASTを用いてホモログを検索した <- ホモログ検索の方法
さらに、NCBI nucleotide and Ensembl genome databasesを用いて、追加で８個のホモログを見つけた<- ホモログ検索の方法②
GeneDB databaseにより３つの原生生物のホモログが発見された。
multiple sequence alignmentを実行した。（結果: Figure 1） <- Figureに記されてるのはMAELのみ、C末端も見たい。C末端でドメイン検索してみる。
MAEL homologues間ではEHHCHCモチーフが特に保存されていた。

Domain annotation showed that mouse MAEL protein contains a HMG domain in its N-terminal segment, which is a DNA-binding module in many non-histone components and transcriptional regulators [32]. However, no domain information could be assigned for the C-terminal segments of MAEL proteins (240 amino acids long). We conducted homologous sequence searching for this region using PSI-BLAST against the NCBI NR database. Many unique homologues were identified in a broad range of species from veterbrates, echinoderms, insects, nematodes, to the protists (Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, and Trypanosoma brucei). We also examined NCBI nucleotide and Ensembl genome databases and identified eight other homologues in insects and urochordates (Ciona intestinalis and Ciona savignyi). Three more protist homologues were obtained through searching GeneDB database. A multiple sequence alignment was built for all the retrieved sequences (additional file 1) and a condensed one is shown in Figure 1. Although the overall sequence identity is very low, the conservation is apparent across all these MAEL homologues. Six residues Glu-His-His-Cys-His-Cys (EHHCHC) are highly conserved, suggesting that they may contribute to MAEL-specific activity. Thus the C-terminal segment appears to define a novel MAEL-specific domain that we now refer to as the MAEL domain.

大部分の種でMaelドメインは1コピーしか存在しなかった
他の種類ではいくつかのホモログが存在した; ホヤや蚊（A. aegypti）では２コピー、アカイエカ（Culex pipiens）では３コピー、アメーバ（E. dispar や E. histolytica）では５コピー存在した。
系統樹で解析すると系列特異的な重複によってmultiple MAEL copiesが発生したと考えられる。

既に調査された全ての種類のゲノムデータベースにおいてMAELは発見されなかった。 (Danio rerio, Gasterosteus aculeatus, Oryzias latipes, Takifugu rubripes and Tetraodon nigroviridis)
魚と哺乳類が種分化してから魚だけでMAELの欠失が起こった。
魚類にだけあったゲノム重複でMAELが失われたのかもしれない。

For the majority of species, only one copy of MAEL domain exists. However, there are multiple MAEL homologues in several other species; for instance, two copies are found in sea squirts (C. intestinalis and C. savignyi) and mosquito (A. aegypti), three copies in Culex pipiens, and five copies each in amoeba E. dispar and E. histolytica. Phylogenetic tree construction suggests that multiple MAEL copies are generated from a series of ancient lineage-specific duplication events (Figure (Figure2A).2A). Strikingly, no fish MAEL homologues could be identified. Its absence in teleost fish was confirmed by carefully examining the published whole genome databases in Ensembl for five different species (Danio rerio, Gasterosteus aculeatus, Oryzias latipes, Takifugu rubripes and Tetraodon nigroviridis). It can be inferred that it is the ancestor of the fish lineage after the divergence of teleost and tetrapod lineages that underwent the loss of MAEL domain. The timing of the loss is probably related to the ancient fish-specific genome duplication [33].

Functional insight from domain architectures

HMG、HDAC_interact、SR-25-like domainがMAELドメインと関連している。

HMGはクロマチン関連タンパク質によく見られるDNA結合モジュールで、ゲノム再編成、転写開始、DNA修復での核タンパク質複合体に機能的に関わっている。
多くの種でMAELとHMGドメインが共存していることはMAELドメインがDNAに関連したプロセスで機能することを示唆している。 <- MDsimulationで相互作用見る？
MAELドメインとHDAC_interactドメインが共存することもMAELがDNAに関連したプロセスに関わっていることを示唆する。 <- MDsimulationで相互作用見る？
HDAC_interactドメインはクロマチン再編成でヒストン脱アセチル化酵素（HDACs）として中核的に働くことが知られている。
ある生物で２つの異なるfusion homologueを持つということは、それらのドメインは他の生物では協働して働く可能性が高い。（ロゼッタストーン仮説） <- 現在のゲノムでfusion homologueをサーチしてみる。
蚊のMAELはロゼッタストーンタンパク質であり、他の生物でMAELとHDAC_interactドメインを含むタンパク質が相互作用している仮説が立てられる。
SR-25-like ドメインとMAELドメインの相互作用はRNA関連プロセスとMAELとの関連を示す。
SR-25-likeドメインはRNA認識モチーフ(RRM)やSR-25ドメインと離れた場所で関連しRNAスプライシングに関わるPRP38と関連づけられている。（SCOOP programにより明らかになった） <- 現代版のゲノムで関連因子を探索するためにSCOOP programも実行してみる。
ドメインの構造はMAELドメインがDNA結合、RNA結合、クロマチン再編成に関わっている事を示唆する。

Three other domains are associated with MAEL domains, including HMG (SMART: SM00398), HDAC_interact (SMART: SM00761), and SR-25-like domain (DUF1777, Pfam: PF08648) (Figure (Figure2B).2B). HMG is a common DNA-binding module in a variety of chromatin-associated proteins and functionally involved in the nucleoprotein complex assembly during genome recombination, initiation of transcription, and DNA repair [32]. The association between MAEL and HMG domains in most species suggests that the MAEL domain may somehow function in a DNA-related process. This functional assignment is also suggested by the association of MAEL domain with HDAC_interact domain in two homologues from mosquitoes (A. aegypti and A. gambiae). The HDAC_interact domain is known to bind to histone deacetylases (HDACs), core enzymes for removing acetyl group from lysine residue of histones during chromatin remodeling process [34]. It has been observed that pairs of interacting domains in one organism may have a fusion homologue composing of these two domains in another organism, known as the rosetta stone protein theory [35]. Mosquito MAELs may be rosetta stone proteins and it can be hypothesized that there are interactions between other MAEL and some HDAC_interact-containing proteins in other species. Indeed, it has been illustrated that mouse MAEL can interact with the SIN3B protein which contains an HDAC_interact domain [30]. The associated SR-25-like domain provides another link between the MAEL domain and RNA-related process. The SR-25-like domain is associated with RNA-binding modules, RNA recognition motif (RRM) [26] and PRP38 [36], It is also distantly related to SR-25 domain which may be involved in RNA splicing, as revealed by the SCOOP program [37]. Therefore, domain architecture suggests a potential involvement of MAEL domains in DNA binding, RNA binding and chromatin remodeling.

A distant similarity between MAEL domains and the DnaQ-H 3'–5' exonuclease family with the RNase H fold

fold recognition strategyにより離れて（異なった配列をとるが同じ構造をとって）MAEL domainsと関連するものを特定しようとした。
remote homologyの場合、保存的なタンパク質の折り畳み構造はシークエンスが異なっていても維持されるという理論(rationale)。
meta server（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12824313/）が利用され、 3D-JURYシステムによってモデリングされた構造が評価された。
human, X. tropicalis, Ciona and DrosophilaのMAEL domainsがクエリとして用いられ、MetaBasic, ORFeus and BasicDistでヒットした構造が特定された。
カットオフスコアである50を下回っていたが、得られた全ての構造がRNase H foldを持つDnaQ-H 3'–5' エキソヌクレアーぜファミリーに属していることがわかった。
先祖である赤痢アメーバのMAELドメインをクエリとして用いてみた。
11個の構造が58–69のスコアでヒットし、全てDnaQ-H 3'–5'ぬくれあーぜファミリーに属していた。
DnaQ-HとMAELドメインの構造的類似性が判明したので関係性をPSI-BLASTでもう一度調べてみた。
PSI-BLASTによってDnaQ-HエキソヌクレアーぜがE valueが0.05以下ではないが、検出されていることに気づいた。

We applied a fold recognition strategy to identify remotely related homologues of MAEL domains. The rationale is that in the case of remote homology, conserved protein structural folds can be kept despite limited sequence identity [38]. A meta server was utilized, which assembles various state-of-the-art fold recognition methods and further evaluates modeled structures based on a consensus score computed by a 3D-JURY system [39]. MAEL domains from human, X. tropicalis, Ciona and Drosophila were first used as queries and several structural hits were identified by MetaBasic, ORFeus and BasicDist with consensus scores from 21 to 46. Although these 3D-Jury scores are below the cutoff 50, which corresponds to correct assignment with statistical significance [40], domain and fold examinations showed that all retrieved structures belong to the DnaQ-H 3'–5' exonuclease family with the RNase H fold [41,42]. We extended our search using an ancestral E. histolytica MAEL domain (GI: 67477376, residues 315–532) as a query. Eleven structural hits were identified with high scores around 58–69, and they all belong to the DnaQ-H 3'–5' exonuclease family. Structural fold similarities between DnaQ-H and MAEL domains encouraged us to re-examine this relationship using PSI-BLAST. We noticed that several DnaQ-H exonucleases can be retrieved as insignificant candidates in our initial PSI-BLAST searching with a profile inclusion expectation (E) value of 0.005. However, when we set inclusion E value at 0.05, significant similarity between the first 100aa segment of MAEL domains and several prokaryotic DnaQ-H exonucleases was achieved in the fourth iteration.

次にMAELドメインとDnaQ-H 3'–5' エキソヌクレアーゼで構造に基づいたmultiple sequence alignmentsを行い、このホモログの関係を調べた、
DnaQ-H ドメイン間での配列類似性は低いので、「CE-MC server」で調査された構造情報をもとにアラインメントが作られた。
その後、そのアラインメントをfold recognition resultsと予測された二次構造の情報をもとにアラインメントされたMAELドメインの情報と合わせた。
最終的なアラインメントはMAELとDnaQ-Hドメインの間で保存された残基を明らかにした。
MAELドメインでRNase H foldの３個のベータシート構造に対応する構造はalpha helixと予測されたが、これは間違いだと考えられる。(RNase H foldでも予測間違いが起こったため)
MAELドメインの二次構造はDnaQ-H 3'–5'エキソヌクレアーぜに似ている。（どちらもβ1- β2- β3- α1- α2- β4- α3- β5- α4- α5- α6の構成を持つ）
さらに重要なことに、DnaQ-Hに特徴的な配列（Asp-Glu-Asp-His-Asp, DEDHD）を共有している。
これらの残基は多様なDnaQ-H 3'–5'エキソヌクレアーぜで共有されており、２つの二価金属イオンと相互作用して活性部位を作る。
配列類似性は低いが構造的類似性と原生生物MAELでの共通モチーフ（DEDHD）があることから進化t系な関連が示唆された。

We next examined this homologous relationship by building structure-based multiple sequence alignments for MAEL domains and DnaQ-H 3'–5' exonucleases. Since sequence identity among different DnaQ-H domains is very low, their alignment was first generated based on structural information as assessed by a CE-MC server [43] followed by manual adjustment based on published literature. Thereafter, we combined this alignment with the aligned MAEL domains based on fold recognition results and predicted secondary structures. The final alignment showed the conserved residues among/between two domains and compositions of secondary structures (Figure (Figure3A).3A). It is to be noted (Figure (Figure3A)3A) that equivalents of beta sheet (β) 3 of the RNase H fold in most MAEL domains are predicted to be alpha helix (α). We believe that this is a wrong prediction since in the canonical RNase H fold, β3 is an edge β strand, which can usually be misidentified as an α helix because of its solvent sequence property [44]. As shown in Figure Figure3A,3A, the secondary structures of MAEL domains resemble those of DnaQ-H 3'–5' exonucleases; both have a β1- β2- β3- α1- α2- β4- α3- β5- α4- α5- α6 composition. More importantly, several ancestral protist MAEL domains also share all the critical DnaQ-H characteristic residues (Asp-Glu-Asp-His-Asp, DEDHD). These residues are commonly utilized by diverse DnaQ-H 3'–5' exonucleases and interact with two divalent metal ions to form an active site [45-47]. Thus, in contrast to a very low sequence identity (<15%) between MAEL domains and DnaQ-H 3'–5' exonucleases, the similar structural fold and the notable existence of DEDHD residues in protist MAEL domains strongly support a distant evolutionary relationship.

Structural examinations on active sites by DEDHD and EHHCHC residues in MAEL domains

comparative modeling.. homology modeling
DEDHD... 原生生物のMAELでは構造的中核になっていてDnaQ-H domainsの活性部位と似ていた。
他の種ではDEDHDはみられなかったが、EHHCHCはみられた。
モデリングされたMAELの構造において、EHHCHCの場所を調べた。
全てのMAELに特異的な残基は似通った位置にあった。
EHHchCはstructural coreを形成しうる上、他の２残基もそれに向かい合っている。
最後のCHCを形成するα5 and α6で似たような変化が見られた。
C178 and C189 のCysでジスルフィド結合が見られるかもしれない。
DnaQ-HのDEDHD残基はDnaQ-H 活性部位を形成するが、EHHCHC残基を持つ他のMAELドメインは標準的なRNase H 足場に基づいた新たな活性部位を形成する可能性がある。

The tertiary structures of protist and chicken MAEL domains were further constructed by comparative modeling. Like DnaQ-H domains (Figure 3B, C), these MAEL domains adopt a similar RNase H structural fold which is characterized by a compact α/β fold with open anti-parallel β sheets in the middle and several α helices surrounded (Figure 3D, E).
Moreover, the characteristic DEDHD residues in protist MAEL domains are clustered into a structural core, which resembles active sites of DnaQ-H domains (Figure 3A, B, C). In contrast, most other MAEL domains lack the DnaQ-H specific residues DEDHD. However, they are characterized by another conserved stretch of residues, EHHCHC. During evolution such conservation of MAEL-specific residues may reflect functional contributions most likely to a distinct active site. The spatial locations of EHHCHC residues were then examined in these modeled MAEL structures to check their possibility of forming an active site. Unexpectedly, we found that all MAEL-specific residues have very close spatial locations and they are clustered together at one side of the middle anti-parallel β sheets (Figure (Figure3E).3E). Four residues (EHHchC) can shape a structural core and other two residues may also potentially face down to it with slight structural rearrangements. Similar change of structural conformations of α5 and α6 comprising last CHC residues has been observed in crystal structures of DnaQ-H domains (additional file 2). There may exist another possibility that a disulfide bond (-S-S-) is formed between two Cys residues (C178 and C189 in the chicken MAEL domain) because of their close proximity. This is also supported by disulfide bond predictions [48]. Formation of a disulfide bond may facilitate the last His to approach other EHH residues, thus forming an active site with EHHH residues. Therefore, structural examinations suggest that protist MAEL domains with DEDHD residues may form a DnaQ-H active site whereas other MAEL domains with EHHCHC residues may potentially form a new active site based on the canonical RNase H scaffold.

Discussions and conclusion

Functional insight into MAEL in germline piRNA pathway

提案されたMAELドメインとRNase H foldを持つDnaQ-H 3'–5' エキソヌクレアーぜの進化的な繋がりによりMAEL domainsの機能が推測できる
DnaQ-H 3'–5' exonuclease family（DEDDh exonuclease family or Exonuc_X-T domain）はRNase H fold superfamilyのmemberであり、RNase H, mu transposase, crossover junction resolvase RuvC, and PIWI domain familiesを含む。これらは全てcanonical RNase H foldを含むが、活性部位は異なる。
DnaQ-H familyは５つの保存された残基（DEDHDドメイン、二価の陽イオンと共に活性部位を作る）により特徴付けられる。
DnaQ-H familyのメンバーは核酸の代謝に関わる。（例: replicative proofreading (1J53:A) [47], DNA repair or RNA degradation (exonuclease I and oligoribonuclease) [45,46], and RNA interference (ERI-1) [53]. ）
EDDHD残基により形成される活性部位は3'–5' exonuclease activityを形成する。酸性の DEDDは２つの金属イオンと3'末端を収納する負の電荷のポケットを形成する。次に結合した金属イオンと保存されたHが結合鎖と直接相互作用し、核酸の3'–5' directionリン酸ジエステル結合を切断する。したがって、DnaQ-H に特異的なDEDHD残基と活性部位を持つ原生生物のMAELドメインは3'–5'エキソヌクレアーぜ活性を持つかもしれない。（関連する金属イオンと標的は未知だが）

The proposed evolutionary link of MAEL domains to DnaQ-H 3'–5' exonuclease with RNase H fold may provide functional clues for MAEL domains. The DnaQ-H 3'–5' exonuclease family, also known as DEDDh exonuclease family or Exonuc_X-T domain (Pfam ID: PF00929), is one member of RNase H fold superfamily (SCOP: 53098) which also includes RNase H, mu transposase, crossover junction resolvase RuvC, and PIWI domain families [24,49-52]. They all share a canonical RNase H fold but contain different active site residues. The DnaQ-H family is characterized by five conserved residues, DEDHD, which form an active site in coordination with divalent metal ions (Figure (Figure3A).3A). Its members contribute to diverse nucleic acid metabolism processes such as replicative proofreading (1J53:A) [47], DNA repair or RNA degradation (exonuclease I and oligoribonuclease) [45,46], and RNA interference (ERI-1) [53]. Although different nucleotide targets (DNA or RNA) or diverse metal ions (Zn2+, Mg2+, or Mn2+) are involved [45-47], their active sites formed by the EDDHD residues delineates a common 3'–5' exonuclease activity. That is, the acidic DEDD together with two metal ions shape a negative pocket, which provides space for accommodating the 3' termini of oligonucleotide (DNA or RNA) chains. Thereafter, the coordinated metal ions and another conserved H are in direct contact with the bound chain, which induces a break of the phosphodiester bond of nucleotide in the 3'–5' direction [46]. Therefore, protist MAEL domains, harboring DnaQ-H specific DEDHD residues and active sites, may also employ a 3'–5' exonuclease activity, although their associated metal ions and nucleotide targets are still unknown.

原生生物のMAEL domainと異なり最近のMAELドメインはDnaQ-H に特異的な残基を持っていないが、特徴的なEHHCHC残基を持つ。
EHHCHC または EHHHのような構造的なコアを形成しうるとわかった。
MAELにはDnaQ-Hがないのでこの部位がRNA-binding abilityを持つかもしれない
RNase H foldは配列の類似度は低く異なる活性部位残基を含むが、全て金属イオンと協働したDNA/RNA 3' または 5' end-directed nuclease活性を持つ。

In contrast to the protist MAEL domains, most recent MAEL domains do not contain the DnaQ-H specific residues but are characterized by the EHHCHC residues. What is the functional contribution of these residues to MAEL domains? Structural observations showed that a structural core can be potentially formed by the MAEL-specific residues EHHCHC or EHHH. This may provide a structural basis for an active site. On the one hand, this active site may confer RNA-binding ability for MAEL domains because of the lack of DnaQ-H specific residues. In this way, MAEL may contribute to stabilizing or positioning the RNA substrate in piRNA pathway. On the other hand, MAEL-specific residues and its potential active site may define another nuclease activity. We noticed that although all related families with the RNase H fold have low sequence identities and contain different active site residues, they all have DNA/RNA 3' or 5' end-directed nuclease activities with metal ion coordination in their own active sites [50,51]. For example, RNase H is a non-specific endonuclease whose catalytic activity requires divalent ions (Mg2+ or Mn2+) and is responsible for the hydrolysis of the RNA in a DNA/RNA duplex [52,54]. In contrast, PIWI domains contribute to 5'-3' exonulcease catalytic activity for the Argonaute family proteins (Slicer) in all types of small RNA pathways (siRNA, miRNA, and piRNA). The activity is achieved by three PIWI active site residues, DDH, in coordination with one divalent ion and used to cleave single-stranded RNA substrate guided by complementary double-stranded small RNAs (piRNA or siRNA) [23,24,55-57]. It seems that the RNase H structural fold is an efficient scaffold from which diverse nuclease families have evolved distinct nuclease activities by developing their own active site residues with metal ion coordination. Therefore, being one member of RNase H superfamily, the MAEL domain may share this characteristic, thus the residues EHHCHC may form an active site with a new nuclease activity. It has been shown in diverse proteins that H, C and E residues often interact with Zn2+ [58]. Moreover, the residue composition of EHHH is commonly utilized by several Escherichia coli proteins including ColE7 endonuclease [59], Zinc transport protein ZnuA [60], and Aldolase (1DOS) for their active sites, which also interact with metal ions, especially Zn2+ [61],

Experimental evidence have suggested that MAEL may be involved in piRNA biogenesis since its loss-of-function mutant impairs the production of piRNAs or rasiRNAs and increases the transcript level of transposable elements [11]. Different from siRNA and miRNA pathways, piRNAs biogenesis employs a Dicer-independent mechanism [4,10]. A ping-pong model has been recently proposed for this process and it is hypothesized that AGO3 bound to the sense strand of piRNAs catalyzes cleavage of the antisense strand that generates 5' end of antisense piRNAs. The 3' end of the resulting antisense piRNAs is subjected to a 3' cleavage by an unknown endonuclease or exonuclease and a HEN1-processed 3' methylation. Thereafter, the produced antisense piRNAs associate with Aubergine or PIWI and direct cleavage of transposon sequences, which then generates the sense strand piRNAs after 5' cleavage, 3' cleavage and 3' methylation [5,7,8]. This cycling model is not complete since the exonuclease or endonuclease enzyme responsible for the 3' terminal maturation remains uncharacterized [5,7,8]. Thus, because of its evolutionary relationship to 3'–5' DnaQ-H exonuclease and the potential (3'–5' exo-) nuclease activities, MAEL may be the nuclease candidate implicated in the cleavage of the 3' termini. Recently, the nucleases Zucchini and Squash have been proposed as the 3' termini nuclease candidate based on the evidence that they are also located in germ plasm and have a similar mutation phenotype in a loss of transposon silencing [18]. However, MAEL is distinct from those above two nucleases due to its translocation between germ plasm and nucleus and the direct interaction with chromatin remodeling proteins [21,30]. We believe that multiple nucleases are involved in the diverse steps of piRNA pathway in a sequential manner, similar to PIWI family members targeting 5' cleavage of piRNAs [62]; and MAEL is involved in a genomic DNA-related piRNA step, which may include chromatin remodeling process and initial transcriptions of transposon. In this way, MAEL-associated HMG domain or other chromatin remodeling proteins facilitate the access of piRNA complex to the genomic regions where are enriched with transposon sequences. The transposon transcripts undergoing processing interact with the piRNA complex in which PIWI, one RNase H member, generates 5' end of transposon transcripts via a piRNA-directed homologous cleavage whereas MAEL, another RNase H member, contributes to a 3' terminal cleavage of transposon transcripts.

MDシミュレーション（Coarse-Grained Model）によるLLPS様の FUS Proteinの凝集体の解析

1ut — Wed, 28 Apr 2021 13:12:19 +0000

Abstract

導入

変性タンパク質と核酸が凝集してLLPSを起こす
MD simulationsにより物理化学的な特性やLLPSの組成や大きさを決めるfactorを決定するユニークな手法

Disordered proteins and nucleic acids can condense into droplets that resemble the membraneless organelles observed in living cells. MD simulations offer a unique tool to characterize the molecular interactions governing the formation of these biomolecular condensates, their physicochemical properties, and the factors controlling their composition and size.

従来の問題点

生体高分子の凝集はエネルギーまたはエントロピーの寄与の影響のバランスにセンシティブに依存する

However, biopolymer condensation depends sensitively on the balance between different energetic and entropic contributions.

新規にわかったこと

生体高分子の相分離の動力学シミュレーションのポテンシャルエネルギー関数をfine-tuneする一般的な手法を開発した
溶媒およびエントロピー的な寄与に対するタンパク質-タンパク質の相互作用のバランスを、「希薄溶液と縮合物の間でタンパク質が移動する際の過剰な自由エネルギーに合わせて」見直した。

Here, we develop a general strategy to fine-tune the potential energy function for molecular dynamics simulations of biopolymer phase separation. We rebalance protein–protein interactions against solvation and entropic contributions to match the excess free energy of transferring proteins between dilute solution and condensate.

実験の内容

FUSのlow-complexity domain (LCD) のドロップレット形成を、rebalanced MARTINI model（?）でシミュレーションすることでこの関数を実証した。
粗視化したMARTINI potential energy functionのなかで、非結合相互作用の強さをスケーリング（?）することで、「タンパク質濃度」と「相互作用の強さ」の状態図（phase diagram）を描いた。（map out）

We illustrate this formalism by simulating liquid droplet formation of the FUS low-complexity domain (LCD) with a rebalanced MARTINI model. By scaling the strength of the nonbonded interactions in the coarse-grained MARTINI potential energy function, we map out a phase diagram in the plane of protein concentration and interaction strength.

critical scaling factor　αc が 0.6以上の時、FUS-LCD の凝集が観察された。ここで、α = 1 と α = 0はMARTINI modelにおける完全な相互作用と反発相互作用に対応する。
scaling factor α が 0.65 の時、実験的に希薄相と密集相の密度を測定した。
それにより、タンパク質がドロップレットに入るときの過剰な自由エネルギーとFUS-LCDが凝集する時の飽和濃度が得られた。

Above a critical scaling factor of αc ≈ 0.6, FUS-LCD condensation is observed, where α = 1 and 0 correspond to full and repulsive interactions in the MARTINI model. For a scaling factor α = 0.65, we recover experimental densities of the dilute and dense phases, and thus the excess protein transfer free energy into the droplet and the saturation concentration where FUS-LCD condenses.

相分離の領域では、希薄相とFUS-LCD密集板の間でFUS-LCDのドロップレットを数十ミリ秒間、４つの異なるサイズでシミュレーションした。
1ms以上、凝集した状態のシミュレーションを行なった。
表面張力を、ドロップレットの形の変動や、２つの相の間のcapillary-wave-like broadeningから0.01–0.4 mN/m の範囲で決定した。

In the region of phase separation, we simulate FUS-LCD droplets of four different sizes in stable equilibrium with the dilute phase and slabs of condensed FUS-LCD for tens of microseconds, and over one millisecond in aggregate. We determine surface tensions in the range of 0.01–0.4 mN/m from the fluctuations of the droplet shape and from the capillary-wave-like broadening of the interface between the two phases.

タンパク質の端から端までの距離から、scaling factors α を 0.625–0.75（相分離が観察できた範囲）に設定して0.001 から 0.02 Pa sまでの範囲でFUS-LCD のドロップレットの粘度を測定した。
液滴の内部が著しく水和することでタンパク質と液滴の流動性が保たれる。

From the dynamics of the protein end-to-end distance, we estimate shear viscosities from 0.001 to 0.02 Pa s for the FUS-LCD droplets with scaling factors α in the range of 0.625–0.75, where we observe liquid droplets. Significant hydration of the interior of the droplets keeps the proteins mobile and the droplets fluid.

Introduction

LLPSの例
stress granules, processing bodies, nucleoli（核小体）, Cajal bodies（mRNAのプロセッシング）

Intracellular compartmentalization into organellar structures is crucial for the organization of cellular biochemistry in time and space. Cell nuclei and mitochondria are examples of subcellular compartments bounded by a lipid membrane, whereas stress granules, processing bodies, nucleoli, or Cajal bodies are membraneless.(1−6) Disordered proteins and nucleic acids can cluster to form biomolecular condensates with liquid-like properties.(1,2,7,8) Such condensates formed by liquid–liquid phase separation (LLPS) in vitro mimic the membraneless organelles in cells.(1,2)

Individually weak but multivalent interactions between intrinsically disordered proteins (IDPs), in some cases amplified by condensing factors, are major drivers of LLPS.(4,8) The biomolecular condensates produced by LLPS behave as liquid droplets immersed in dilute solution.(7) Their liquid-like interior facilitates the rapid diffusion of reactants within the condensates and their exchange with the outside.(9) Their dynamic nature also makes biomolecular condensates a promising template for novel biomimetic materials.(10,11) The rational design of new materials will benefit from predictive models that relate the static and dynamic materials properties of biomolecular condensates to the protein and nucleic acid sequences(10) and the molecular interactions they encode.

Mac でVim（MacVim）でファイルを開く方法・MacVimをapplication folderに出現させる方法

1ut — Wed, 28 Apr 2021 10:41:29 +0000

MacVimをapplication folderに出現させる方法

Macvimのinstall

brew install macvim

Macvim.appの位置の確認

ls /usr/local/Cellar/macvim/8.2-171/MacVim.app

[8.2-171]の部分はinstallしたversionによって異なるので注意

/Applicationにsymbolic linkを作成

ln -s /usr/local/Cellar/macvim/8.2-171/MacVim.app /Applications

そしたらこんなふうに出てくる

Mac でVim（MacVim）でfileを開く方法

上記の「MacVimをapplication folderに出現させる方法」を実行

↓

vimで開きたい拡張子のfileを右click -> get info -> open withからmacvimをselect、change allをclick

Crystal Structure and Activity of the Endoribonuclease Domain of the piRNA Pathway Factor Maelstrom

1ut — Tue, 27 Apr 2021 10:07:09 +0000

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124715002995?via%3Dihub

Summary

PIWI-interacting RNAs (piRNAs) protect the genome from transposons in animal gonads.

MAELはショウジョウバエやマウスで見られるpiRNA-mediated　transcriptional transposon silencingに必要な進化的に保存されているタンパク質である
Maelはhigh-mobility group（HMG）とMAEL domainにより構成される。

Maelstrom (Mael) is an evolutionarily conserved protein, composed of a high-mobility group (HMG) domain and a MAEL domain, and is essential for piRNA-mediated transcriptional transposon silencing in various species, such as Drosophila and mice.

However, its structure and biochemical function have remained elusive.

Here, we report the crystal structure of the MAEL domain from Drosophila melanogaster Mael, at 1.6 Å resolution.

MAELドメインがRNase H-like foldを持っているがRNase H-like superfamily nucleasesで保存されている標準的な触媒残基を欠いていることが明らかになった

The structure reveals that the MAEL domain has an RNase H-like fold but lacks canonical catalytic residues conserved among RNase H-like superfamily nucleases.

MAELはsingle-stranded RNA (ssRNA)に特異的なendonuclease活性を持つこともわかった

Our biochemical analyses reveal that the MAEL domain exhibits single-stranded RNA (ssRNA)-specific endonuclease activity.

ショウジョウバエにおいてはmaelのssRNA cleavage activityがなくてもpiRNA-mediated transcriptional transposon silencingが起こると示唆された

Our cell-based analyses further indicate that ssRNA cleavage activity appears dispensable for piRNA-mediated transcriptional transposon silencing in Drosophila.

MaelのpiRNA パスウェイにおける様々な役割を理解する鍵になる

Our findings provide clues toward understanding the multiple roles of Mael in the piRNA pathway.

Introduction

Small RNA-based defense systems repress the aberrant expression of transposable elements (TEs) and thus maintain genome integrity in animal gonads (Malone and Hannon, 2009, Siomi et al., 2011).

The germline-specific PIWI clade of Argonaute family proteins and the 23- to 30-nt noncoding PIWI-interacting RNAs (piRNAs) are the core of this defense system.

PIWI proteins bind piRNAs to form piRNA-induced silencing complexes (piRISCs), which silence their complementary target TEs at the transcriptional or posttranscriptional level (Malone and Hannon, 2009, Siomi et al., 2011, Ishizu et al., 2012, Luteijn and Ketting, 2013).

ショウジョウバエのPIWIタンパク質: Piwi, Aubergine (Aub), and Argonaute3 (AGO3)

The Drosophila genome encodes three PIWI proteins: Piwi, Aubergine (Aub), and Argonaute3 (AGO3).

ショウジョウバエ卵巣は濾胞細胞などの体細胞と保育細胞や卵母細胞などの生殖細胞により構成される

The Drosophila ovary consists of two types of cells, somatic cells such as follicle cells, and germ cells such as nurse cells and oocytes.

Piwiは体細胞と生殖細胞のどちらにも分布する。
体細胞と生殖細胞はprimary piRNA pathwayに参加する

Piwi is localized in the nucleus in both somatic and germ cells, where it participates in the primary piRNA pathway (Czech et al., 2013, Handler et al., 2013, Olivieri et al., 2010).

対照的にAub と AGO3　は生殖細胞の核周辺の顆粒（nuageと呼ばれる）に局在する
secondary piRNA biogenesisに参加する

In contrast, Aub and AGO3 are enriched in cytoplasmic perinuclear granules called nuage in germ cells, where they participate in secondary piRNA biogenesis (Brennecke et al., 2007, Gunawardane et al., 2007, Li et al., 2009, Malone et al., 2009).

ショウジョウバエ卵の体細胞のprimary piRNA pathwayでは一本鎖で長いpiRNAの前駆体が不連続な遺伝子座であるpiRNA clustersから転写される。その後Zucchiniと呼ばれる一本鎖に特異的なendoribonucleaseにより処理され成熟する。

In the primary piRNA pathway in Drosophila ovarian somatic cells, single-stranded, long piRNA precursors are transcribed from discrete genomic loci, called piRNA clusters, and are processed into mature piRNAs by the single-strand-specific endoribonuclease Zucchini (Zuc) (Ipsaro et al., 2012, Nishimasu et al., 2012).

primary piRNAsは核周辺の顆粒であるYb bodyにloadされる

The primary piRNAs are loaded into Piwi at cytoplasmic perinuclear Yb bodies (Saito et al., 2010).

piRISCが核に入りrepressive histoneであるH3 lysine 9 trimethylation (H3K9me3)を促進する。それによりTE(トランスポゾン)を転写レベルでsilencingする

piRISC then enters the nucleus and promotes repressive histone H3 lysine 9 trimethylation (H3K9me3), thereby silencing target TEs at the transcriptional level (Sienski et al., 2012, Wang and Elgin, 2011, Le Thomas et al., 2013, Rozhkov et al., 2013).

secondary piRNAの生合成の経路では、Aub と AGO3は交互にトランスポゾンの転写物（それぞれsenseとantisense）を切断する、

In the secondary piRNA biogenesis pathway, Aub and AGO3 reciprocally cleave sense and antisense TE transcripts, respectively (Brennecke et al., 2007, Gunawardane et al., 2007).

このfeed-forwardなpiRNA増幅経路はping-pongcと呼ばれ、secondary piRNAの生合成とTE silencingを同時に行うことができる

This feed-forward piRNA amplification loop, called the ping-pong cycle, enables simultaneous secondary piRNA biogenesis and TE silencing.

Maelは進化的に保存されてきた、piRNAのパスウェイに関わるタンパク質

Maelstrom (Mael) is an evolutionarily conserved protein implicated in the piRNA pathway (Lim and Kai, 2007, Soper et al., 2008, Aravin et al., 2009, Sienski et al., 2012, Castañeda et al., 2014).

ハエの卵巣の体細胞では、Maelは主に核に局在する

In somatic cells of the fly ovary, Mael is predominantly localized in the nucleus (Sienski et al., 2012).

対照的にハエ卵巣やマウス精巣の生殖細胞ではMaelは核や細胞質の顆粒に局在する
顆粒はハエではnuage、マウスではpiP-bodies またはchromatoid bodiesと呼ばれる

In contrast, in germ cells of the fly ovary and mouse testis, Mael is localized in both the nucleus and cytoplasmic granules (nuage in flies, piP-bodies or chromatoid bodies in mice) (Findley et al., 2003, Costa et al., 2006, Lim and Kai, 2007, Soper et al., 2008, Aravin et al., 2009, Sato et al., 2011, Castañeda et al., 2014).

Maelは卵母細胞の発生や生殖幹細胞（GSC)の分化に関係がある

Mael is also implicated in various biological processes, such as oocyte development and germline stem cell (GSC) differentiation (Clegg et al., 1997, Clegg et al., 2001, Pek et al., 2009, Pek et al., 2012, Sato et al., 2011).

MaelはN末端のHMG domainと中央のMAEL domainにより構成され、RNase H-like foldをとるとバイオインフォマティクス的なアプローチで予測されてきた。

Mael is composed of an N-terminal HMG domain and a central MAEL domain, which was predicted to adopt an RNase H-like fold by a bioinformatics analysis (Zhang et al., 2008) (Figures 1A and S1).

しかしMaelの生化学的な機能は不明

However, the biochemical function of Mael remains elusive.

maelのノックダウンはpiRNA生合成に影響しなかったがトランスぽゾンの抑制が脱抑制された。maelはPiwi-mediated TE silencingに不可欠。

In cultured Drosophila ovarian somatic cells (OSCs) (Niki et al., 2006, Saito et al., 2009), mael knockdown (KD) did not affect piRNA biogenesis but resulted in the derepression of TEs, indicating that Mael is essential for Piwi-mediated TE silencing (Sienski et al., 2012).

興味深いことに、maelのノックダウンはH3K9me3 patternsにあまり影響を与えなかった。maelはPiwiの仲介するH3K9me3の導入の下、または並行で働くと示唆された。

Intriguingly, mael KD only modestly impacted the H3K9me3 patterns at the target heterochromatic loci, suggesting that Mael acts downstream of or in parallel to the Piwi-mediated H3K9me3 modification (Sienski et al., 2012).

加えて、maelはハエ卵巣やマウスの精巣の生殖細胞でpirnaの生合成に関係がある。

In addition, Mael has been implicated in piRNA biogenesis in germ cells of the fly ovary and mouse testis (Lim and Kai, 2007, Sienski et al., 2012, Aravin et al., 2009, Castañeda et al., 2014).

piRNA経路におけるmaelの重要な役割にもかかわらず、Mael/Piwiにより仲介されるトランスぽゾンのsilencingにおける分子機構はわかっていない

Despite the crucial role of Mael in the piRNA pathway, the molecular mechanism of Mael/Piwi-mediated TE silencing remains elusive, due to the lack of structural and biochemical information.

D. melanogaster MaelのMAELドメインの構造を解いた。

In this study, we solved the crystal structure of the MAEL domain of D. melanogaster Mael.

構造によるとMAEL domainはRNase H-like構造をとるが、RNase H-like superfamilyで保存されている標準的なcatalytic residuesを欠いていることがわかった。

The structure revealed that the MAEL domain adopts an RNase H-like fold but lacks the canonical catalytic residues conserved among the RNase H-like superfamily of endonucleases and exonucleases.

しかしMAEL domainはsingle-stranded RNA開裂活性をもち、それはMael/Piwimediated transcriptional TE silencing に必須ではないとわかった。

Moreover, our biochemical and biological analyses revealed that the MAEL domain has single-stranded RNA (ssRNA) cleavage activity, which appears dispensable for Mael/Piwi-mediated transcriptional TE silencing in Drosophila OSCs.

これらの発見はMaelの多機能性を解明する手がかりになる

Our findings provide clues toward understanding the multiple functions of Mael in the piRNA pathway.

Results

Crystal Structure of the MAEL Domain from D. melanogaster Mael

full-lengthのMaelは大腸菌での発現で収量が少なかったため構造決定できなかった。

Crystal Structure of the MAEL Domain from D. melanogaster Mael
To gain mechanistic insights into the function of Mael, we attempted to determine the crystal structure of full-length D. melanogaster Mael (residues 1–459, referred to as FL-DmMael) but were hampered by its low expression levels in Escherichia coli.

FL-DmMaelの　「Limited trypsin proteolysis」　によりMAEL domainがよく発現していて、構造解析に適した安定な領域だとわかった。

Limited trypsin proteolysis... 限定プロテアーゼ処理 (Limited Proteolysis)
。タンパク質表面の動きやすい部分をプロテアーゼで限定的に切断・除去することにより、結晶化の可能性を上げようというもの???

http://enzyme13.bt.a.u-tokyo.ac.jp/limited_proteolysis.html

Limited trypsin proteolysis of FL-DmMael revealed that the MAEL domain (residues 84–333, referred to as DmMAEL) is a well-expressed, stable region suitable for structural analysis (Figure 1A).

さらに、進化的に保存されていないCys228をセリンに置換することで回折像の質が劇的に上昇した

Furthermore, we found that the substitution of a less-conserved cysteine residue (Cys228) with serine dramatically improved the diffraction quality.

決勝の蛍光スペクトルによるとDmMAELは亜鉛イオンに結合すると示唆した。

亜鉛イオンはMael orthologs間で保存されるECHCモチーフと結合するとした以前のbioinformatics研究と一致する

X-ray fluorescence spectra of the crystal indicated that DmMAEL binds a zinc ion, consistent with a previous bioinformatics analysis suggesting that a zinc ion is coordinated by the ECHC motif, which is conserved among Mael orthologs (Zhang et al., 2008) (Figures S1 and S2).

DmMAELの結晶回折像を1.6 Å、nativeに結合している亜鉛イオンを用いたSAD法で決定した。

We determined the crystal structure of DmMAEL (C228S) at 1.6 Å resolution by the single-wavelength anomalous diffraction (SAD) method, using the intrinsic zinc atom (Figure 1B; Table S1).

DmMAELは13ヘリックスに囲まれたtwisted５本鎖βシート構造だとわかった。

亜鉛はECHC モチーフのGlu131, Cys288, His291, Cys300と結合していた。

The structure revealed that DmMAEL consists of a twisted five-stranded mixed β sheet surrounded by 13 helices, with a zinc ion coordinated by Glu131, Cys288, His291, and Cys300 in the ECHC motif (Figure 1C).

Dali searchによりDmMAELはエンドヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼのRNase H-like superfamilyと構造的に類似しているとわかった。特にLassa virusのnucleoprotein（LASV NP）の様な、DEDDh family エキソヌクレアーゼと類似していた。

A Dali search (Holm and Rosenström, 2010) revealed that DmMAEL shares structural similarity with the RNase H-like superfamily of endonucleases and exonucleases (Majorek et al., 2014), especially with the DEDDh family exonucleases, such as a Lassa virus nucleoprotein (LASV NP) (PDB 4GV9) (Jiang et al., 2013).

LASV NPはウイルス応答インターフェロン産生の抑制に関わるエキソヌクレアーゼである。

LASV NP is a 3′–5′ exonuclease involved in the suppression of virus-induced interferon production (Martínez-Sobrido et al., 2007, Qi et al., 2010, Hastie et al., 2011, Jiang et al., 2013).

sequence identityは低いが、RNase H-like foldをLASV NPと共有している。

Despite their low sequence identity (∼13%), DmMAEL shares an RNase H-like fold, consisting of a five-stranded β sheet flanked by α helices on both sides, with LASV NP (Jiang et al., 2013) (root mean square deviation of 2.9 Å for 131 aligned Cα atoms) (Figure 1D).

DmMAELのように、LASV NPはGlu399, Cys506, His509, and Cys529から成るECHCモチーフと結合した亜鉛イオンを含む。

これは構造安定化や基質との結合に寄与するのかもしれない。

Like DmMAEL, LASV NP contains a zinc ion coordinated by the ECHC motif, consisting of Glu399, Cys506, His509, and Cys529, which may contribute to structural stabilization or substrate binding (Qi et al., 2010, Hastie et al., 2011) (Figures 1E and S3A).

DmMAELでは結合した（bound）亜鉛イオンは少なくとも構造的な役割は果たしている。

なぜならECHC motifの点変異はDmMAELの溶解度を著しく低下させるから。

In DmMAEL, the bound zinc ion may play at least a structural role, since point mutations of the ECHC motif drastically reduced the solubility of DmMAEL in vitro (data not shown).

DEDDh familyエキソヌクレアーゼは触媒残基（Asp, Glu, Asp, Asp, and His; DEDDh motif）から構成された負に帯電した触媒溝をもち、two-metal-ion mechanismにより二重鎖RNAを切断する。

two-metal-ion mechanism...

The DEDDh family exonucleases have a negatively charged catalytic groove formed by five invariant catalytic residues (Asp, Glu, Asp, Asp, and His; DEDDh motif) and cleave double-stranded RNAs (dsRNAs) through a two-metal-ion mechanism (Zuo and Deutscher, 2001).

LASV NPではcatalytic grooveはDEDDh motif内のAsp389, Glu391, Asp466, Asp533, and His528と、高度に保存されているSer430, Gln462, and Arg492の残基から構成されている。

In LASV NP, the catalytic groove is formed by Asp389, Glu391, Asp466, Asp533, and His528 in the DEDDh motif and the highly conserved Ser430, Gln462, and Arg492 residues (Hastie et al., 2012, Jiang et al., 2013) (Figures 1F and S3B).

LASV NPのAsp389, Glu391, Asp466, Asp533, and His528残基はDmMAELのAla114, Asn116, Met218, Met304, and Tyr299に対応する。

The Asp389, Glu391, Asp466, Asp533, and His528 residues of LASV NP respectively correspond to the Ala114, Asn116, Met218, Met304, and Tyr299 residues of DmMAEL (Figures 1F and S3B).

したがって、LASV NPの触媒溝と対応するDmMAELの中央の溝は負に帯電していない。

Consequently, the central groove of DmMAEL, which corresponds to the catalytic groove of LASV NP, is not negatively charged (Figure 1G).

加えて、中心溝の残基はMaelのorthologs間で保存されていない、そのため中心溝はMaelの機能に重要でないことが示唆される。

In addition, the residues in the central groove are not conserved among Mael orthologs (Figures S1 and S2), suggesting that the central groove is less important for the function of Mael.

まとめとして、DmMAELの結晶構造はRNase H-like foldをとることが明らかになったが、RNase H-like superfamily members間で保存されている標準的な触媒残基を欠いているとわかった。

Taken together, the crystal structure of DmMAEL revealed that it adopts an RNase H-like fold but lacks the canonical catalytic residues conserved among RNase H-like superfamily members.

The MAEL Domain Has Single-Strand-Specific Endoribonuclease Activity

DmMAELがヌクレアーゼかどうか決定するために、精製したDmMaelを用いて、 5′ 32P-labeled 40-nt ssRNA を基質として調べた。

To determine whether DmMAEL is a nuclease, we measured the nuclease activity of purified DmMAEL using a 5′ 32P-labeled 40-nt ssRNA (40AS ssRNA) as the substrate.

意外にも、DmMAELは40AS ssRNAを分解した。

Unexpectedly, DmMAEL cleaved the 40AS ssRNA (Figure 2A).

精製されたDmMAELの

The elution profile of purified DmMAEL correlated closely with that of the single-stranded ribonuclease (ssRNase) activity in gel-filtration chromatography (Figure 2A).

さらに、DmMAELは40AS ssRNAを量及び時間に応じて分解した。

Furthermore, DmMAEL cleaved the 40AS ssRNA in a dose- and time-dependent manner (Figures 2B and 2C).

DmMAELはssRNaseである

These results revealed that DmMAEL is a ssRNase.

DmMAELのssRNase activityにはMg2+ or Ca2+の様な二価の金属イオンを必要としない。むしろそれらが存在すると抑制された。

The ssRNase activity of DmMAEL did not require divalent metal ions, such as Mg2+ or Ca2+, and was rather inhibited in their presence (Figure 2D).

これらの結果は、DmMAELがDEDDh family memberと、基質の分解にMg2+ and Mn2+を必要とする触媒残基を共有していないという構造的発見と一致している。

These results are consistent with our structural finding that DmMAEL shares no catalytic residues with the DEDDh family members, which require divalent metal ions, such as Mg2+ and Mn2+, for substrate cleavage (Zuo and Deutscher, 2001).

DmMAELの基質特異性を見るために 5′ 32P-labeled nucleic acid substratesの分解活性を見た

To determine the substrate specificity of DmMAEL, we next measured the cleavage activity toward a series of 5′ 32P-labeled nucleic acid substrates.

DmMAELは効率的にssRNAを分解したが、dsRNA と ssDNAは分解しなかった。

DmMAEL efficiently cleaved ssRNA, but neither dsRNA nor ssDNA (Figure 2E).

DmMAELは環状40AS ssRNAをを分解した -> DmMAELはendoribonuclease

DmMAEL cleaved circular 40AS ssRNA, indicating that DmMAEL is an endoribonuclease (Figure 2F).

40AS ssRNAの分解様式はDmMAELが優先的にssRNAをグアニン残基で分解することを示した。

The cleavage pattern of the 40AS ssRNA revealed that DmMAEL preferentially cleaves ssRNA at a guanine residue (especially at successive guanine stretches) (Figure 2E).

40AS ssRNA がDmMAELによる分解に影響する二次構造をとる可能性を排除するために、15-nt poly(A) RNA　基質に対するDmMAELのnuclease activityをグアニン残基の有無どちらについても測定した。

To exclude the possibility that the 40AS ssRNA adopts a secondary structure that affects the cleavage by DmMAEL, we measured the nuclease activity of DmMAEL toward 15-nt poly(A) RNA substrates with or without guanine residues, which are unlikely to adopt secondary structures.

DmMAELはグアニン残基を含む15ntのpoly(A)を切断したが、15ntのpoly(A)は切断しなかった。このことからssRNAをグアニン残基で切断することが確かめられた。

DmMAEL cleaved 15-nt poly(A) containing guanine residues, but not 15-nt poly(A), confirming that DmMAEL cleaves ssRNA at guanine residues (Figure 2G).

次に40AS ssRNAの分解パターンをDmMAEL と RNase T1（ssRNAをグアニン残基の3'末端で分解する）で比べた。

We next compared the cleavage patterns of the 40AS ssRNA by DmMAEL and RNase T1, an endonuclease that specifically cleaves ssRNA at the 3′ side of guanine residues (Pace et al., 1991).

RNase T1は40AS ssRNAをどの場所のグアニン残基でも分解した。対照的に、DmMAELは3 nt from the 5′ endと4 nt from the 3′ endで分解しなかった。

RNase T1 cleaved the 40AS ssRNA evenly at guanine residues (Figure 2H). In contrast, DmMAEL did not efficiently cleave the 40AS ssRNA at 3 nt from the 5′ end (position 1) and 4 nt from the 3′ end (position 6) (Figure 2H).

DmMAELのssRNase に対する活性は25 mM NaCl存在下で阻害された。一方、RNase T1のssRNase に対する活性は100 mM NaClでも阻害されなかった。

The ssRNase activity of DmMAEL was inhibited in the presence of 25 mM NaCl, whereas that of RNase T1 remained robust in the presence of 100 mM NaCl (Figure 2I).

これらの酵素学的特徴の違いは、DmMAELのRNA分解機構はRNase T1と全く異なっていることを示す。

These differences in their enzymatic properties indicated that the RNA cleavage mechanism of DmMAEL is distinct from that of RNase T1.

nuclease activityがD. melanogaster Maelに特異的かどうか調べるために、カイコのmaelと、マウスのmaelについてssRNase activitiesを測定した。

To examine whether the nuclease activity is specific to D. melanogaster Mael, we measured the ssRNase activities of the purified MAEL domains from Bombyx mori Mael (residues 92–335, referred to as BmMAEL) and Mus musculus Mael (residues 83–327, referred to as MmMAEL) (Figure 2J).

BmMAEL　と MmMAELは40AS ssRNAをDmMAELと同じ様に分解することを発見した。ただしMmMAELのssRNase 活性はDmMAEL や BmMAELと比べると弱かった。

We found that both BmMAEL and MmMAEL cleave the 40AS ssRNA in similar manners to that of DmMAEL, although the ssRNase activity of MmMAEL was weaker than those of DmMAEL and BmMAEL (Figure 2J).

これらの生化学的データは、MAELドメインは進化的に保存された、一本鎖に特異的なエンドリボヌクレアーゼだと明らかにした。

Together, these biochemical data revealed that the MAEL domain is an evolutionarily conserved, single-strand-specific endoribonuclease.

Potential RNA-Binding Residues of the MAEL Domain

MAELが標準的な DEDDh motif　を欠いているため、Mael orthologsの配列の保存性に着目してDmMAELの触媒残基を特定しようとした。

Since the MAEL domain lacks the canonical DEDDh motif, we tried to identify the catalytic residues of DmMAEL, based on the sequence conservation among Mael orthologs.

しかし、ECHC motifがsolvent accessible（溶媒露出）で保存された唯一の領域だとわかった。

However, multiple sequence alignments indicated that only the ECHC motif is solvent accessible and strictly conserved across the Mael orthologs (Figures S1 and S2).

DmMAELの結晶構造に基づいて、solvent-exposedかつ親水性の残基がそれぞれアラニンに置換された12個のDmMAEL mutantを用意した。

Thus, based on the crystal structure of DmMAEL, we prepared 12 DmMAEL mutants, in which the solvent-exposed, hydrophilic residues were individually substituted with alanine (Figure 3A).

ゲルろかカラムで一つの単分散のピークをとって溶出したので、構造が完全な状態だと確かめた、

All of the mutants eluted as a single monodisperse peak from the gel-filtration column (data not shown), confirming their structural integrity.

精製された変異体のssRNase activitiesを40AS ssRNAを基質として用いることで調査した。

We then examined the ssRNase activities of the purified mutants, using 40AS ssRNA as the substrate (Figure 3B).

K109A, K188A, N192A, E292Aの変異体はwild-type DmMAELに相当するssRNase activities活性を持っていた。一方K277A突然変異体は若干活性が下がった。

The K109A, K188A, N192A, and E292A mutants showed ssRNase activities comparable to that of the wild-type DmMAEL, and the K277A mutant showed moderately reduced ssRNase activity (Figure 3B).

対照的に、K140A, K199A, Q289A, D293A, D295A, D314A, and K328A突然変異体ではssRNase activitiesの著しい低下が見られた。Lys140, Lys199, Gln289, Asp293, Asp295, Asp314, and Lys328がssRNase活性に関わることを示す。

In contrast, the K140A, K199A, Q289A, D293A, D295A, D314A, and K328A mutants showed markedly reduced ssRNase activities (Figure 3B), indicating that Lys140, Lys199, Gln289, Asp293, Asp295, Asp314, and Lys328 are involved in the ssRNase activity.

DmMAEL, BmMAEL, and MmMAELが同じようにssRNAを分解したにもかかわらず、Asp295以外の残基は保存されていなかった。

Although DmMAEL, BmMAEL, and MmMAEL cleaved ssRNA in a similar manner (Figure 2J), these residues (except for Asp295) are not conserved among the Mael orthologs (Figure S1).

さらに、これらの突然変異ではssRNase activityは低下したものの、完全に無くならなかった。これはこれらの残基がssRNA bindingに関わるが触媒として働いている訳ではないと示唆する。

Moreover, these mutations reduced, but did not abolish, the ssRNase activity (Figure 3B), suggesting that these residues are involved in ssRNA binding, but not in catalysis.

正に帯電したLys140, Lys199, Lys328の様な残基はssRNA 基質の負に帯電したリン酸バックボーンと相互作用しうる。

The positively charged residues, Lys140, Lys199, and Lys328, would interact with the negatively charged phosphate backbone of the ssRNA substrates.

これらの残基は LASV NP の触媒溝に相当するcentral grooveの逆側に位置していた。

These residues are located on the opposite side of the central groove, which is equivalent to the catalytic groove of LASV NP (Figures 3C and 3D).

central grooveがssRNase activityに関わるか調べるため、４つの additional DmMAEL mutants（N116A, M218A, Y299A, and M304A）を用意した。

これによりDEDDh motifを構成する残基一つ一つをアラニンに置換した。

To examine whether the central groove is involved in the RNase activity, we tried to prepare four additional DmMAEL mutants (N116A, M218A, Y299A, and M304A), in which the residues corresponding to the DEDDh motif were individually substituted with alanine.

これらの４つの突然変異体はE. coliで可溶性タンパク質として発現しなかったが、構造の純正さを保つのに必須であると示唆する。

These four mutants were not expressed in E. coli as soluble proteins (data not shown), suggesting that these residues within the central groove contribute to structural integrity.

加えて、C228S突然変異体はssRNase activityを示した。

C228Sの突然変異はDmMAELの構造と機能に大きな影響を持っていないことを示唆する。

In addition, the C228S mutant used for our structural analysis exhibited the ssRNase activity (Figure 3B), indicating that the C228S mutation does not have considerable impact on the structure and function of DmMAEL.

DmMAEL と RNase T1 がssRNAをグアニンで優先的に分解するため、それらの構造類似性,をみようとした。

Since both DmMAEL and RNase T1 preferentially cleave ssRNA at guanine residues, we attempted to detect the structural similarity between them.

RNase T1はssRNAを、保存されたヒスチジンを触媒残基としてmetal-ion-independent mechanismで分解する。

RNase T1 cleaves ssRNA through a metal-ion-independent mechanism, in which a conserved histidine serves as a catalytic residue (Pace et al., 1991).

DmMAELのHis329がDmMAEL, BmMAEL, and MmMAELで保存されている唯一のヒスチジンであるため、DmMAEL H329A mutantのRNase activityを測定した、

Since His329 of DmMAEL is the only histidine residue conserved among DmMAEL, BmMAEL, and MmMAEL (Figure S1), we examined the RNase activity of the DmMAEL H329A mutant (Figure 3A).

その結果His329はssRNA分解に関わっていなかった。

The H329A mutant retained the ssRNase activity, indicating that His329 is not involved in ssRNA cleavage (Figure 3B).

我々の多数の試みにもかかわらず、RNAの分解の仕組みは解明できなかった。

Thus, despite our numerous attempts, the RNA cleavage mechanism remains to be elucidated.

しかし、我々の変異解析はRNase T1またはDEDDh family membersと活性部位を共有しないという仮説を支持する。

Nonetheless, our mutational analyses support the notion that Mael does not share an active site with either RNase T1 or the DEDDh family members.

The ssRNase Activity of Mael Appears Dispensable for Piwi/Mael-Mediated TE Silencing in Drosophila OSCs

MAEL domainのPiwi/Mael-mediatedトランスポゾンサイレンシングへの寄与を見るために、DmMAEL, FL-DmMael、４つのECHC-motifの点変異体、ECHC-motifの４モチーフ全ての変異体をmaelをdepletedさせたOSCにおいて過剰発言させ、qRT-PCRによってトランスポゾンの発現レベルをモニターした。

To examine the contribution of the MAEL domain to Piwi/Mael-mediated TE silencing, we overexpressed DmMAEL, FL-DmMael, the four ECHC-motif single mutants (E131A, C288A, H291A, and C300A) of FL-DmMael, the ECHC-motif quadruple mutants (E131A/C288A/H291A/C300A) of FL-DmMael, and DmMAEL in mael-depleted OSCs and then monitored the expression levels of TEs by qRT-PCR.

FL-DmMael and DmMAELは体細胞のトランスぽゾンの抑制解除をレスキューした。これはMAEL domainがトランスぽゾンのサイレンシングに中心的な役割を果たしているという従来の結果と一致する。

FL-DmMael and DmMAEL rescued the derepression of a variety of somatic TEs (mdg1, 297, blood, Tabor, gypsy, and ZAM) (Figures 4A, 4B, and S4A), indicating that the MAEL domain plays a central role in Piwi/Mael-mediated TE silencing in Drosophila OSCs, consistent with a previous report (Sienski et al., 2012).

全てのECHC-motifの変異体はトランスぽゾンの抑制解除のレスキューに失敗した。ECHC-motifがトランスぽゾンの抑制解除に重要だとわかった。

All of the ECHC-motif mutants of FL-DmMael and DmMAEL failed to rescue TE derepression (Figures 4A and S4B), highlighting the functional significance of the ECHC motif for Piwi/Mael-mediated TE silencing.

DmMAELのssRNase activityがPiwi/Mael-mediated トランスポゾンサイレンシングに関わっているかどうか調べるために、K140A, K199A, Q289A, D293A, D295A, D314A, and K328Aをmael-depleted OSCsに入れてトランスポゾンの抑制の解除があるかどうかみた。

To examine whether the ssRNase activity of DmMAEL is involved in Piwi/Mael-mediated TE silencing, we next overexpressed the seven ssRNase-deficient DmMAEL mutants (K140A, K199A, Q289A, D293A, D295A, D314A, and K328A) in mael-depleted OSCs and then monitored the levels of TE derepression.

wild-type DmMAELのように、改変ssRNaseはトランスぽゾンの抑制解除をレスキューした。

Like wild-type DmMAEL, all seven of the ssRNase-deficient mutants rescued TE derepression (Figures 4A and S4C).

DmMAELのECHC-motifの変異体は大腸菌において不溶性だったためssRNase activitiesを調べられなかった

Since the ECHC-motif mutants of DmMAEL were not expressed in E. coli as soluble proteins, we could not examine their ssRNase activities in vitro.

結果としてMaelのssRNA 分解活性はPiwi/Mael-mediated TE silencingに不要だとわかった。

Overall, these results suggested that the ssRNA cleavage activity of Mael appears dispensable for Piwi/Mael-mediated TE silencing in Drosophila OSCs.

Discussion

DmMAELの結晶構造からDmMAELはRNase H-like foldを採用するがRNase H-like superfamily membersと触媒残基を共有しないことがわかった。

The present crystal structure revealed that DmMAEL adopts an RNase H-like fold but does not share catalytic residues with the RNase H-like superfamily members.

意外にもDmMAELはssRNase activityを持っていた

Unexpectedly, our biochemical analyses revealed that DmMAEL has ssRNase activity.

BmMAEL や MmMAELはssRNase activitiesを持っており、DmMAELにおける７つの潜在的なssRNA-binding 残基を特定した。

We further showed that BmMAEL and MmMAEL also have the ssRNase activities, and we identified seven potential ssRNA-binding residues of DmMAEL.

これらの結果はMAEL domainがssRNase activityを持っていることを強く支持した。RNase H-like superfamily nucleasesに保存されている活性部位を欠いている。

These results strongly support our surprising finding that the MAEL domain possesses the ssRNase activity, although it lacks the canonical active site conserved across the RNase H-like superfamily nucleases.

以前の研究でMaelはハエ卵巣やマウス精巣の生殖細胞においてpiRNA生合成に関わるとわかった。

Previous studies showed that Mael participates in piRNA biogenesis in germ cells of the fly ovary and mouse testis (Lim and Kai, 2007, Sienski et al., 2012, Aravin et al., 2009, Castañeda et al., 2014).

マウスの精巣においてMael, the PIWI protein MIWI, and the Tudor-domain-containing protein TDRD6を構成するリボヌクレオタンパク質の複合体がpachytene piRNAの前駆体から成熟体への処理に関わっていることが知られている。

In the adult mouse testis, a ribonucleoprotein complex comprising Mael, the PIWI protein MIWI, and the Tudor-domain-containing protein TDRD6 is involved in the processing of precursor transcripts into mature pachytene piRNAs, a class of mammalian piRNAs (Castañeda et al., 2014).

特筆すべきことに、MIWIのヌクレアーゼ活性はpiRNA生合成に必要とされず、リボ核タンパク質の複合体は予想されるヌクレアーゼを持っていなかった。Maelはマウス精巣内でpachytene piRNAの処理を担っているのかもしれない。

Notably, the nuclease activity of MIWI is not required for piRNA biogenesis (Reuter et al., 2011), and the ribonucleoprotein complex lacks a potential nuclease (Castañeda et al., 2014), suggesting that Mael may be responsible for the processing of pachytene piRNA precursors in adult mouse testis.

このモデルはMmMAELがssRNase activityを持つという発見に一致する、

This model is consistent with our finding that MmMAEL exhibits the ssRNase activity.

これらの結果はmaelのssRNase activityがマウス精巣でpiRNA 前駆体の処理に関わっていると示唆する

Together, these observations suggested that the ssRNase activity of Mael is involved in the processing of piRNA precursors in mice.

以前の研究ではMAELドメインはDrosophila OSCsでのPiwi/Maelによるトランスポゾンのサイレンシングにおいて中心的な役割を果たしてきた。

A previous study showed that the MAEL domain plays a central role in Piwi/Mael-mediated TE silencing in Drosophila OSCs (Sienski et al., 2012).

OSCにおいて、maelのノックダウンはH3K9me3の形成にあまり影響しないが、標的となるヘテロクロマチンの遺伝子座において、RNA polymerase IIのoccupancyを高めることで（?）トランスポゾンを抑制する

In OSCs, the mael KD has mild effects on the establishment of H3K9me3 but increases RNA polymerase II occupancy at target heterochromatic loci, thereby resulting in the derepression of TEs (Sienski et al., 2012).

これらの結果はMaelがH3K9me3の改変の下流または並行して働くと示している

These observations indicated that Mael acts downstream of or in parallel to the H3K9me3 modification event.

大規模な遺伝子のスクリーニングにより、Piwi and Maelに加えて、zinc finger domain-containing proteinであるGtsf1やトン脱アセチル化酵素HDAC3やヒストンのシャペロンであるAsf1がハエの体細胞のpiRNA合成経路に関わっていると示された。

A large-scale genetic screen further indicated that, in addition to Piwi and Mael, the zinc finger domain-containing protein Gtsf1 (Dönertas et al., 2013, Ohtani et al., 2013) and several chromatin-associated factors, such as the histone deacetylase HDAC3 and the histone chaperone Asf1, are involved in the Drosophila somatic piRNA pathway (Handler et al., 2013, Muerdter et al., 2013).

以前の研究と一致して、我々の細胞学的な解析はハエOSCにおいてトランスポゾンのサイレンシングに関わっていると示された。

Consistent with the previous report (Sienski et al., 2012), our cell-based analysis indicated that the MAEL domain is involved in TE silencing in Drosophila OSCs.

遺伝子改変による解析によると、MAEL domainのssRNase activityはトランスぽゾンのサイレンシングにssRNase activityは不要だとわかった。

Our mutational analysis further suggested that the ssRNase activity of the MAEL domain appears dispensable for TE silencing.

したがって、Maelは他のpiRNA 因子とMAEL domainで相互作用し、トランスポゾンのサイレンシングに関わっていると提案する。

Thus, we propose that Mael interacts with other piRNA factors via the MAEL domain and thereby participates in TE silencing in Drosophila OSCs.

bioinformaticsの解析ではMAEL domainは、触媒残基をDEDDhからECHCにすることでDEDDhエキソヌクレアーぜから進化した。だからnuclease activityを持っているのかもしれない。

A previous bioinformatics analysis suggested that the MAEL domain evolved from a DEDDh exonuclease by switching the catalytic residues from the DEDDh motif to the ECHC motif and that the MAEL domain may possess the nuclease activity (Zhang et al., 2008).

実験結果はこれと一致した。

Consistent with this, our structural and biochemical data revealed that the MAEL domain lacks the DEDDh motif but shows ssRNase activity.

Mael orthologsでECHC motifが保存されていることを考えると、ECHC motifが触媒として働くのかもしれない。

Given that the ECHC motif is strictly conserved among Mael orthologs (Figures S1 and S2), the ECHC motif may play a catalytic role in addition to a structural role.

この考えはECHC motif付近にあり、高度に保存されているDmMAELのAsp295がssRNase activityに関わっていることからサポートされる。

This idea is supported by the observation that Asp295 of DmMAEL, which is highly conserved and located close to the ECHC motif, is involved in the ssRNase activity.

もしECHC motifが触媒反応に関わるなら、MaelのssRNase activityがDrosophila OSCsにおいてTE silencingにかかわると予想される。ECHC-motifを改変した結果トランスポゾンが起こらなかったからだ。

If the ECHC motif participates in catalysis, then it is possible that the ssRNase activity of Mael is involved in TE silencing in Drosophila OSCs, since the ECHC-motif mutants failed to rescue TE derepression in our cell-based rescue experiments.

ssRNase活性を持たないDmMAELの変異体はわずかなssRNase活性を維持しており、OSCで過剰発言させた場合サイレンシングに十分であったと予想される。

All of the ssRNase-deficient DmMAEL mutants we examined in our cell-based assays retained slight ssRNase activities in vitro, which might be sufficient for TE silencing when overexpressed in OSCs.

rimary piRNAの生合成に関わるエンドリボヌクレアーゼであるZucに対する以前の研究では、トランスポゾンの抑制は触媒作用をなくしたZucの導入ではレスキューされなかったが、RNAに結合できないZucの変異体は説明不可能なssRNase activityを保持していた。

Indeed, in our previous study on Zuc, an endoribonuclease implicated in primary piRNA biogenesis, TE derepression was not rescued by the overexpression of the catalytically inactive Zuc mutant but was efficiently rescued by the overexpression of the RNA-binding-deficient Zuc mutants retaining residual ssRNase activity (Nishimasu et al., 2012).

maelによるトランスポゾンサイレンシングにおいてssRNase activityが必要でないとは言い切れない

Thus, we cannot completely rule out the possibility that the ssRNase activity of Mael is required for TE silencing.

Maelの多様な機能について理解するためには

ssRNAの分解機構
Mael内在性の基質ssRNA
MaelのssRNase活性の生理的関連性（?）

が明らかにならなくてはならない。

To fully understand the multiple roles of Mael, an enigmatic key factor in the piRNA pathway, it will be critical to elucidate (1) its ssRNA cleavage mechanism, (2) its endogenous ssRNA substrates, and (3) the physiological relevance of its ssRNase activity.

MDシミュレーション　用語集

1ut — Thu, 22 Apr 2021 08:22:34 +0000

conformational ensemble

IDP（intrinsically disordered proteins、本質的に構造を取らないタンパク質）について計算により求められた構造のモデル。

MDシミュレーション（Atomistic Simulations）によるLLPSにおける変性タンパク質の相互作用解析

1ut — Tue, 20 Apr 2021 07:52:48 +0000

ソース https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jpcb.0c06288

概要

タンパク質中の変性領域がLLPSの足場になっている
足場となるタンパク質のアミノ戦配列がどのようにphase separationを起こすのかまだわかっていない
phase separationにおけるモデル分子であるN末端のDEAD-boxヘリカーゼ4（NDDX4）についてexplicit-solventシミュレーションを行った
NDDX4について単分子レベルでcomformational ensembleを決定し、分割統治的な手法によって他のタンパク質の高濃度でのシミュレーションに基づいて分子間相互作用が本当の凝集ぶつをmimickしているか調べた
めも: NDDXは236残基からなるタンパク質のN末端
NMRおよび変異解析の結果と一致した詳細データを得て、アルギニンや芳香族の残基が縮合に関わっていることを示唆した

イントロ

phase separationでの変性領域の重要性

NMRでLLPS時にも構造のflexibilityが保存されていることがわかっている。また、LLPSは変性領域間での瞬間的な多価的な相互作用(多数の弱い相互作用の重なり)によって維持されている

Furthermore, pioneering NMR studies indicate that this conformational flexibility is preserved even upon LLPS and that the condensed phase is stabilized by a dynamical network of transient multivalent interactions.(14,15)

ポリマー理論によりアミノ酸の荷電の分布によって相分離の起こる分子が説明されてきた

Particularly, polymer theory has been used to rationalize how the patterning of charged residues in the sequence affects both the conformational ensemble of isolated proteins and their phase separation properties.(18−20)

芳香族アミノ酸または側鎖が大きく不飽和であるアミノ酸がLLPSの鍵になっておりpi-stacking相互作用により説明されてきた

Furthermore, several evidences indicate that amino acids with aromatic (Phe, Tyr) or large-sized, unsaturated side-chains (Arg, Gln) are key determinants of in vivo and in vitro LLPS,(10,14,17,21−24) and π–π or cation−π interactions have been invoked to rationalize these observations.(25)

LLPSのdriving forceの解明にはMDシミュレーションが使われてきた。

1残基１ビーズの粗視化モデルは

相分離系のcoexistence curvesの決定
LLPSにおけるリン酸化の働きの説明
単分子のconformational ensembleとphasingの間の相関の調査

に使われてきた。

Notably, coarse-grained (CG) models with a one-bead-per-residue resolution have been successfully applied for determining coexistence curves of model phase-separating systems,(26−28) for rationalizing the role of phosphorylation on LLPS,(29) and for investigating the correlation between single-molecule conformational ensembles and phase behavior.(30)

原子レベルでのシミュレーションは計算量的な制約から非常に限られている

Conversely, the contribution of atomistic simulations to this field has been limited(15,24,34−37)

さらにIDRのconformational propertyの再現についての言説を見るとforce fieldの正確性に欠ける

Furthermore, the accuracy of atomistic force fields in this context has yet to be carefully assessed, considering the debate on their capability of correctly reproducing the conformational properties of IDRs/IDPs.(38−40)

この論文では * 分割統治的な手法 * IDP解析に有効だと確かめられた最新のforce field を用いてexplicit-solventの原子シミュレーションをNDDX4などのphasing分子について行った

メソッド

2.1

ソフトウェア: Gromacs

force field: amber99sb-disp

trajectoryは　v-rescale(43) と Parrinello–Rahman(44) schemes を用いて NPT ensemble (T = 300 K, P = 1 atm) の系で作られた

注 NpT ensembleはisothermal–isobaric ensemble（等温等圧集団）のこと

NDDX4の最初の状態はBradyにより報告された配列をもとにTRaDES-2により生成された

Initial configurations of NDDX4 were generated with TRaDES-2 software(45,46) by using the sequence reported by Brady et al.(14)

タンパク質分子は2290nm3の斜方十二面体、300000原子に溶解された

Protein molecules were solvated in a rhombic dodecahedron box with a volume of ∼2290 nm3, for a total of approximately 300000 atoms.

0.1M NaClにより電荷は中和（?）された

The charge of the system was neutralized with 0.1 M NaCl.

周期的な境界条件が適用され、1nmまでの範囲でparticle mesh Ewald algorithmが適用されて静電相互作用が計算され、ファンデルワールス力は1nmでcutoffされて計算された。

Periodic boundary conditions were applied, and long-range electrostatic interactions were evaluated by using the particle mesh Ewald algorithm(47) with a cutoff of 1 nm for the real space interactions, while van der Waals interactions were computed by using a cutoff distance of 1 nm

LINCS を使用してすべての結合長を制限した。

All bond lengths were constrained by using LINCS,(48)

水素分子は高周波のbond-angle vibrationを取り除くためにvirtual sites(?)に置換された。これにより4fsのtime stepで運動方程式の統合を行うことが可能になった。(計算量的な制約？)

hydrogen atoms were substituted by virtual sites to remove their high-frequency bond-angle vibration, allowing us to use a time step of 4 fs for the integration of the equations of motion.(49)

Each replica was run for 1 μs for a cumulated simulation time of 10 μs.

10psごとにタンパク質の状態は保存され、最初の100nsは解析からのぞいた

Configurations of the protein were saved every 10 ps, and the first 100 ns of each replica was discarded from the analysis.

gmx gyrate と HullRad softwareによりNDDX4の回転角（Rgyr）と流体力学的角度 (Rhyd) が計算された.

The radius of gyration (Rgyr) and the hydrodynamic radius (Rhyd) of NDDX4 were computed with the tool gmx gyrate and the HullRad software,(50)

分子間の接触の確率（contact probability）は、重い原子（H以外？）間の最短距離が0.5nm以下のの時に計算した。ただしペプチド結合４個ぶん以下の距離に位置するアミノ酸ペアは計算からのぞいた。

Intramolecular contact probabilities were evaluated considering a cutoff of 0.5 nm on the minimum distance between the heavy atoms of pairs of residues (Figure S12), excluding amino acids closer than four peptide bonds from the calculation

各残基(i)におけるP_loc(i)の値は[i-3, i+3]の7残基のrolling window（?）のcontact probabilityを計算し平均することにより得た。

The Ploc(i) variable for each residue i was computed by locally averaging the intramolecular contact probabilities of the residues by using a rolling window of seven residues in the interval [i – 3, i + 3].

11個の残基のmoving window（?）を解析することによって電荷を持つ領域およびArgやPheに富んだ領域が定義された

The definition of the charged blocks of amino acids and of regions rich in Arg and Phe was performed by analyzing the sequence with a moving window of 11 residues in the interval i – 5, i + 5.

gromacsのdo_dsspにより計算されたDSSPアルゴリズム(水素結合推定アルゴリズム)により二次構造の情報が推定された。

The DSSP algorithm(51) was employed to estimate the secondary structure propensities from MD simulations via the interface provided by the gmx do_dssp tool.

2.2

12残基のExtended structures(?)はambertoolのleapで生成された

Extended structures of the 12-residue long peptides were generated by using the LEaP program included in AmberTools16.(52)

末端の塩基（何を指す？前の12塩基？）の電荷による人為的な影響を防ぐために、ペプチド末端はACEとNMEグループによりキャップされた

Termini of the peptides were capped by using ACE and NME groups to avoid artificial effects introduced by the charges of the terminal residues

各レプリカ（シミュレーション単位）における初期状態はgromacsのinsert-moleculesというツールによりランダムに挿入された

Initial configurations for each replica were generated by inserting the peptides in random positions and orientations in a rhombic dodecahedron box with a volume of ∼145 nm3 by using the gmx insert-molecules tool available in GROMACS 2018.3.

Flag1、Flag2ではフェニルアラニンをアラニンに置換またはアルギニンをリジンに置換。Frag2: R133K, R135K, F137Aで Flag1: R150K, F153A, R154K, R157K, F160A

For mutants of Frag1 and Frag2 where arginine and phenylalanine residues were mutated respectively to lysine and alanine, mutations correspond to R133K, R135K, and F137A in Frag2 and R150K, F153A, R154K, R157K, and F160A in Frag1 according to NDDX4 sequence numbering.

In the case of the Frag1 + Frag3 system, five copies of each peptide were used

NDDX4のシミュレーションとは異なり水素原子はvirtual sitesに置換されなかった。理由は角自由度を考慮したため。（?）

Unlike the simulations of NDDX4, hydrogen atoms were not replaced with virtual sites, considering all the angular degrees of freedom.

結合長はLINCSを用いて制限された。これにより2fsのtime stepが可能になった（?）

All bond lengths have been constrained by using LINCS,(48) allowing a time step of 2 fs.

それぞれの系において、初期1μ秒間の異なった初期状態から３つの独立した複製がシミュレーションされた。（WT Flag1の系では2μ秒の独立した複製がシミュレーションされた）

For each system, three independent replicas were simulated from different initial configurations for 1 μs, except for the WT Frag1 system, where five independent replicas of 2 μs each were simulated.

10psごとに構造が記録された。intermolecular contact probabilitiesの計算には初期の200ns終了後の1nsごとのフレームが用いられた。

Conformations of the protein molecules have been collected every 10 ps for further analysis. One frame every 1 ns after the first 200 ns was used for the calculation of the intermolecular contact probabilities.

2.3. Structural Heterogeneity of NDDX4 Fragments Complexes

局所的なタンパク質密度...Nc（配位数）で定義。

配位数の計算は距離に基づいたswitchng関数の和をとることで計算された。

We defined an intermolecular residue coordination number NC to probe the local protein density in MD trajectories. This quantity was evaluated for each residue i at time t as a sum of switching functions with the following form:

where rij(t) is the intermolecular distance between the alpha carbons of residue i on chain α and of residue j on chain β at time t, R0 = 1 nm, and the sum runs over all the residues j as long as i and j belong to different chains (α ≠ β).

Nc(i,t)の計算はMDanalysisを用いたpython3スクリプトで行われた。

The evaluation of NC(i,t) was performed with an in-house Python3 script which used the MDAnalysis library(53) to efficiently calculate the intermolecular distances between alpha carbons.

P(NC)の分布は全ての残基、configuration...構造（?）、複製について計算されたNC(i, t)の正規化されたヒストグラムに一致する

The P(NC) distributions correspond to the normalized histograms of NC(i,t) values accumulated over all the residues, the configurations, and the replicas of each system.

NDDXの実際の密度に対応するP(NC)の分布は1000の∼380 mg/mLまでのポリペプチド密度についてのconfigurationについて推定された。

The P(NC) distribution corresponding to the experimental density of NDDX4 condensed phase was estimated by analyzing 1000 configurations with a polypeptide density of ∼380 mg/mL.(14)

このようなconfigurations(?)はgmx insert-molecules toolによって

These configurations were constructed by inserting 25 copies of Frag1 placed within an ∼145 nm3 box by means of the gmx insert-molecules tool. In this procedure, the conformations of individual Frag1 peptides were randomly selected among those observed in MD simulations at ∼150 mg/mL concentration.

2.4 Analysis of Phe/Arg Side-Chain Interactions

フェニル基とグアニジン（アルギニン）の重い原子（?）間のCentroid–centroid距離と最短距離の計算にはPLUMEDが用いられた。また、gmx gangle toolによりrelative orientations ϑ （?）が計算され、mutual positions ϕ （?　←　引用論文: Thermodynamics of stacking interactions in proteins　なのでスタッキング相互作用に重要? ）はpython3のスクリプトで計算した。

Centroid–centroid and minimum distances between heavy atoms of phenyl and guanidinium groups were calculated with PLUMED 2.4.3,(54) and their relative orientations ϑ were computed by using the gmx gangle tool, while mutual positions ϕ were computed as reported by Marsili et al.(55) using an in-house Python3 script.

free energy surfaces(?)の計算については、ϑ と π–ϑ　及び　ϕ と π–ϕ　は区別しないことにした。

In the evaluation of the free energy surfaces, we chose not to distinguish between angles of ϑ and π–ϑ and between angles of ϕ and π–ϕ.(55)

距離、角度の確率分布はD^2で正規化された。Dはcentroid–centroid距離。正規化した理由はangle及び距離のいずれも優先されない場合のflat free energy profileを得るため。（？）

Distance–angle probability distributions were normalized by a factor D2 sin(ϑ) and D2 sin(ϕ),(55) where D is the centroid–centroid distance, to obtain a flat free energy profile in the case of configurations with neither angle nor distance preference.

独立したフェニルアラニン同士の相互作用に対するfree energy surfaceを評価するために、1 μsのMDシミュレーションを２つのuncapped phenylalaninesに対して行った。箱は十二面体で体積が〜11 nm^3。

To evaluate the free energy surface relative to the interaction between isolated phenylalanines, we ran four 1 μs long MD simulations of two uncapped phenylalanines, in a dodecahedron box of volume ∼11 nm3.

双性イオンであるフェニルアラニンの電荷は、アンモニウム基及びカルボキシ基については「a99sb-disp parameters of NPHE and CPHE residue types」を組み合わせて算出した。それ以外の原子についてはPHE残基からのパラメーターを維持した。

Charges for the zwitterionic phenylalanines were obtained by combining the a99sb-disp parameters of NPHE and CPHE residue types for the ammonium and the carboxyl groups, respectively, while keeping the parameters from the PHE residue type for the rest of the atoms (Table S1).

フェニルアラニン及びアルギニンから構成されるより高次な構造の解析については、フェニル基およびグアニジニウム基に属するheavy atomsについて0.5nm以内の距離に位置するものが一つでも存在した場合は2残基は同一のクラスタに属していると見なされた。

In the analysis of higher order structures formed by phenylalanine and arginine, two residues were considered part of the same cluster when at least one pair of heavy atoms belonging to phenyl and guanidinium groups were below the cutoff length of 0.5 nm.

100 psごとのFrag1シミュレーションのConfigurationsが解析に用いられ、gmx trjconv toolを用いて三量体の構造を抽出した。

Configurations every 100 ps of the Frag1 simulations were used for the analysis, and structures of the trimers were finally extracted by using the gmx trjconv tool.

結果とディスカッション

最初にNDDXの単一の構造的特性を調査した。
そのために、1μsのtime scaleで10回MDシミュレーションを行なった。

We first investigated the single-molecule conformational properties of NDDX4 by performing 10 MD simulations in the 1 μs time scale (Figure 1A).

（上図のradius of gyration（Rgyr）は回転半径なので分子の大きさを表す。)

(A: NDDX4はそれぞれのシミュレーションにおいて多様なRgyrを示した。)

(B: ランダムコイルモデルとMDシミュレーションから得られたRgyrの確率分布の相違。）

(C: ）

このtrajectoriesからわかること
・NDDX4は時間に応じて多様な構造をとり、あまり二次構造を持たないflexibleな分子である
これはNMRによる実験結果と一致した。

The trajectories indicated that NDDX4 is a highly flexible molecule with a low secondary structure content (Figure S1) that transiently populates a variety of diverse conformational states, in agreement with the picture provided by NMR.(10,14)

シミュレーションにより得られたconformational ensembleは236残基のタンパク質のrandom-coil近似モデルにより得られた予測よりも小さかった。

The simulated conformational ensemble is rather compact (⟨Rgyr⟩ = 2.9 ± 0.3 nm) for an IDP of this size (236 residues) at variance with the predictions obtained with models based on random-coil approximation (⟨Rgyr⟩ ∼ 4.2 nm)(45,46) (Figure 1B).

MDシミュレーションとNMR diffusion measurementsから得られた流体力学的半径（hydrodynamic radius）の一致により、conformational ensembleの小ささが実験的データと一致し、force fieldの選択が正しかったと再確認される。

The excellent agreement between the hydrodynamic radius predicted by MD (⟨Rhyd⟩ = 3.20 ± 0.16 nm) and the estimate by NMR diffusion measurements (⟨Rhyd⟩ ∼ 3.16 nm)(14) indicates that this compactness is perfectly consistent with experimental data and reassured us on the accuracy of the force field for this system.

変異導入実験により、NDDX4によるLLPSは、フェニルアラニン及びアルギニン残基に加えて、酸及び塩基性の残基間の静電引力にも依存すると明らかにされている。

Mutagenesis experiments(14) have revealed that LLPS of NDDX4 depends on the electrostatic attraction between blocks of acid and basic residues in the protein sequence as well as on phenylalanine and arginine residues.

ここではtrajectoriesにおいて最も多く観察されたresidue–residueのcontactに注目する。

また、residue–residueのcontactについて、NDDX4のphase seperatioinに影響することが知られている「分子的決定要因」（molecular determinants）との相関を調査した。

We focus here on the residue–residue contacts most frequently observed in our trajectories (Figure 1C and Figure S2), and we investigate their correlation with these known molecular determinants of NDDX4 phase behavior.

結果を目視すると、NDDX4の配列内で「逆の電荷」を持つpatchについて単一分子内で相当に相互作用していて、「配列上では離れているタンパク質領域が空間的には近接していることがわかった。」（図Cの左上、青が塩基性で赤が酸性）

Visual inspection of the results suggests that the oppositely charged patches in NDDX4 sequence considerably interact also at the single-molecule level, thus favoring spatial proximity of protein regions that are distant in the sequence (top-left half of Figure 1C).

さらに、局所的にフェニルアラニンとアルギニンに富んだNDDX4の領域は、強く相互作用する傾向を示し、鎖内の理想的なcontactの大部分を占めた。

Furthermore, regions of NDDX4 that are particularly rich in phenylalanine and arginine residues exhibit a strong propensity to interact and account for a large fraction of the most favorable intrachain contacts (bottom-right half of Figure 1C).

特に、それらのfragmentのうちの一つはDDX4のphase separataionに必須であることが知られている132-164領域に対応した。

Notably, one of these fragments corresponds to region 132–164, which is known to be critical for DDX4 phase separation, as splicing variants lacking this region are not able to form organelles.(10)

したがって、シミュレーションではLLPSの形成に必須な領域が単一分子のconformational ensembleの形成に大きく寄与していることがわかった。

Therefore, our simulations suggest that the molecular determinants of NDDX4 phase separation largely contribute to the organization of the single-molecule conformational ensemble.

この点について、我々の詳細なNDDX4の原子的記述は、LinとChanが提案し、タンパク質小断片のMDや解像度の低いCGシミュレーションにより推論されてきたLLPSにおける分子内反応と分子間反応の相互作用の新たな証拠となった。

In this respect, our detailed atomistic description of NDDX4 corroborates the correspondence between intra- and intermolecular interactions in phase-separating systems proposed by Lin and Chan(19) and then inferred from atomistic MD of short protein fragments(24) or lower-resolution CG simulations.(23,27,30,56)

次に、NDDX4の相分離を駆動する分子間の相互作用を検出するために複数のタンパク質でMDシミュレーションを行なった。

We then extended our MD strategy to multiprotein simulations to directly probe the intermolecular interactions that drive the phase separation of NDDX4.

しかし、NDDX4分子が大きく、動きが遅い（?）ためタンパク質の凝集した状態での完全なシミュレーションを行うことは不可能。

Unfortunately, the large size and slow dynamics of NDDX4 currently prevent a satisfactory description of the protein condensed phase by explicit-solvent atomistic MD.

そこで、様々な特徴を持つNDDX4の一部である12塩基のポリペプチドにより形成された分子間相互作用に着目することで、この問題を回避した。

We circumvented this difficulty by focusing on the intermolecular interactions formed by 12-residue-long polypeptides, which correspond to fragments of NDDX4 with diverse features (Table 1).

以下の領域

Flag1: RGSFRGCRGGFG 150–161

Flag2: CEDNPTRNRGFS 117–128

は単一分子のensembleにおいて相互作用の強い領域に対応している。相違点はFrag1は全体の電荷が正なのに対し、Frag2は２つの負の電荷を持つ残基が陽電荷を持つアルギニンと相殺していること。

In particular, while both Frag1 (RGSFRGCRGGFG 150–161) and Frag2 (CEDNPTRNRGFS 117–128) correspond to highly interacting regions which form promiscuous contacts in the single-molecule ensemble, Frag1 is characterized by a positive net charge, whereas in Frag2 two acidic residues counterbalance the two positively charged argininens.

逆に、Frag3: MGDEDWEAEINP 1–12　は負の電荷を持つN末端であり、正の電荷を持つ領域と選択的に結合する一方で、タンパク質の他の領域とはほとんど相互作用しない。

Conversely, Frag3 (MGDEDWEAEINP 1–12) corresponds to the negatively charged N-term (net charge −5), which selectively binds positively charged patches, but it scarcely interacts with the rest of the protein.

10個のタンパク質鎖について１μsのMDシミュレーションを高濃度（∼150 mg/mL）で実行した。

ここで徹底的にFrag1, Frag2, Frag3のホモティピックな相互作用及びFrag1 + Frag3混合物のヘテロティピックな相互作用を見た。

We performed a large set of 1 μs long MD simulations of 10 peptide chains at high concentration (∼150 mg/mL) to exhaustively characterize the homotypic interactions of Frag1, Frag2, and Frag3 peptides and heterotypic interactions in Frag1 + Frag3 mixtures.

このような条件では、ポリペプチドは広範囲でありながら、非常にダイナミックな分子間の相互作用を形成した。また、不可逆的なaggregationを起こすことなく一時的で多様なオリゴマー化状態を取りうる。

In these conditions, the polypeptides form extensive yet highly dynamical intermolecular contacts and transiently explore a wide range of oligomerization states without undergoing irreversible aggregation (see Figure S3).

二次構造の形成は非常に限定的で、完全なNDDX4で観察された場合よりも低かった。

これはポリペプチドのサイズが小さいことから当然の帰結である。

Secondary structure formation is extremely limited (see Figure S4) and lower than what is observed in full-length NDDX4, as expected for polypeptides of limited size.

残基の配位数NC(i,t) を測定することで、ナノメートルスケールでタンパク質の濃度を測定した。

We characterized the local protein density in the nanometer range by measuring the intermolecular residue coordination NC(i,t) number for each residue i (see the Experimental and Theoretical Methods section).

この量により、シミュレーション中の個別の分子により展開された多様性に富む局所的な環境を探ることができる。（独立した鎖から非常に混雑した条件まで）

This quantity probes the diverse local environments explored by individual residues during the simulations, which range from isolated chains to highly crowded conditions (Figure 2A).

そこで、それぞれのシミュレーションされた系の特性を特徴付けるために、全ての残基とtime frameについて累積された全体の分布を利用することにした。

We thus make use of the overall distribution P(NC) cumulated for all the residues and time frames to characterize the behavior of each simulated system.

この解析で３つのフラグメントが高い密度になると相互作用が著しく異なることが明らかになった。

This analysis reveals that the three fragments display markedly different interaction propensities at high concentration (Figure 2B).

Flag1では二峰性の分布が見られた。これらは低密度の領域も高密度の領域も含み（encompasses）、静電相互作用の反発（全体の電荷は+3）と（short-range attractive forces, MDの用語？）の綱引きにより説明される。

The bimodal distribution observed for Frag1, which encompasses both a low-density peak and a higher-density region, can be intuitively explained by a tug of war between electrostatic repulsion (net charge +3) and short-range attractive forces.

この点について、低密度のピークはFrag2（中性の両性化合物であり強い相互作用の傾向がある）の場合は明瞭ではない。

In this respect, the low-density peak is significantly less pronounced in the case of Frag2, which is a neutral polyampholyte with stronger propensity for intermolecular interactions.

逆にFrag3（全体の電荷は-5）の場合では静電的な反発は全く打ち消されておらず、solvated statesを好み、高密度の多量体状態は最小化される。

Conversely, the electrostatic repulsion seems not to be counteracted by compensatory mechanisms in the case of Frag3 (net charge −5), which strongly prefers solvated states and minimizes higher-density oligomers.

このシナリオは反対の電荷を持つFrag1とFrag3の間では全く異なっている。これはNDDX4の集合体の電荷を持つ部分の間の相互作用を模したものであり、密集した状態を強く好む。

This scenario is drastically reversed in the binary mixture of the oppositely charged Frag1 and Frag3, which mimics the interaction between charged patches in NDDX4 condensates and strongly favors highly packed conformations.

観察された配列依存性の振る舞いは単純に総電荷や疎水性度合いにより説明されるものではないが、完全な長さのNDDX4で見られた分子間相互作用の特徴を再現していた。

The observed sequence-dependent behavior is not exhaustively captured by simple parameters, such as net charge and/or mean hydrophobicity, but it recapitulates the intramolecular contact propensity observed in full-length NDDX4 (see Table 1 and Figure S5).

興味深いことに、∼150 mg/mLまでのシミュレーション結果とNDDX4の集合物の実験的な濃度の比較は、MDシミュレーションで見られる一時的なクラスターはナノメートルスケールで現実のドロップレットの環境を再現していると示唆している。

Interestingly, the comparison of results from the simulations at ∼150 mg/mL with the distribution corresponding to the experimental concentration of NDDX4 condensates (∼380 mg/mL)(14) suggests that the transient clusters observed in MD trajectories may reasonably approximate in the nanometer scale the physicochemical environment of real droplets.

結果として、我々のシミュレーションにより、phase separationの起こる環境下で
アミノ酸配列がどのように分子間相互作用を調整しているかを調べることができることを期待している。

As a consequence, we expect that our simulations allow probing how the amino acid sequence modulates collective intermolecular interactions in conditions that are relevant for phase separation.

最近の研究では、IDPの脱混合（相分離形成）は電荷を持つ領域や芳香族の残基のpatterningに影響を受けることを示唆している。

Recent results have suggested that the demixing of phase-separating IDP is affected by the patterning of charged and aromatic residues in their sequence.(20,23)

ポリペプチドのシミュレーションではこのスケールで配列の効果を見ることでができない一方、問題を切り分けて、様々なフラグメント及びそのホモ、ヘテロ間の相互作用がどのように相分離に寄与しているかを調べる効率的な方法を提供する、

While polypeptide simulations cannot directly capture sequence effects at this scale, they provide an efficient way to break up the problem and investigate how the various fragments and their homo- and heterotypic interactions contribute to the phase separation process.

次に、Frag1, Frag2, Frag1 + Frag3の個別の残基間の分子間のcontactの確率の平均に着目することで、配列依存性の相互作用についてより詳しく調査した。

We then investigated in more detail the sequence-dependent interactions by representing the average probability of intermolecular contacts between individual residues in the Frag1, Frag2, and Frag1 + Frag3 simulations (Figure 3).

結果のコンタクトマップから、大きさが小さいにもかかわらず、ペプチドは複雑な相互作用のパターンを示すことが示唆された。

The resulting contact maps suggest that despite their limited size, the peptides exhibit rather complex interaction patterns.

Flag1の場合、芳香族の残基（F4とF11）は分子間相互作用にもっとも寄与しており、優先的にPhe-PheとPhe-Argのペアを形成する。

In the case of Frag1, the aromatic residues (F4 and F11) contribute the most to the intermolecular interactions and preferentially form Phe-Phe and Phe-Arg pairs (Figure 3A).

逆に、Frag2では電荷のある残基や芳香族の残基間で相互作用している。

Conversely, Frag2 interacts through distinct mechanisms involving both charged and aromatic residues (Figure 3B).

ここで、Arg-Asn-ArgモチーフはC末端のフェニルアラニン（F11）及びN末端の酸性残基（E2、D3）と強く相互作用しうるため分子間で軸となる役割を果たしている。

Here, the Arg-Asn-Arg motif represents an intermolecular pivot as it can strongly interact both with the C-terminal phenylalanine (F11) and with acidic residues in the N-terminal part (E2, D3).

Flag1とFlag3の混合物の場合、ホモな相互作用よりも好まれたヘテロな相互作用に着目した。

In the case of the Frag1 + Frag3 mixture, we focus on heterotypic contacts (Figure 3C) which are largely favored over homotypic interactions (Figures S6 and S7).

当然だが、静電相互作用により駆動される逆の電荷を持つペプチドのcoacervationはFrag1ではアルギニン、Frag3ではグルタミン/アスパラギン酸の塩橋により安定化されるが、この場合でさえも、芳香族の残基が最も頻繁なcontactsに関わっていた。（Arg-Trp や Phe-Asn）

Not surprisingly, the electrostatic-driven coacervation of the oppositely charged peptides is stabilized by salt bridges between arginines in Frag1 and glutamate/aspartates in Frag3, although, even in this case, aromatic residues are involved in the most frequent contacts (Arg-Trp and Phe-Asn).

総括として、このように多様なシステムにおける分子間相互作用は二種類の残基間のcontactsによって支配されている。

・芳香族間の相互作用と/または平坦な側鎖や反対の電荷を持つ残基間のイオン結合

Overall, intermolecular interactions in all these diverse systems are dominated by two classes of inter-residue contacts: those between amino acids with aromatic and/or planar side chains and ionic pairing of oppositely charged residues (Figure S8).

この結果（picture）はフェニルアラニンをアラニンに置換した場合　FtoA　またはアルギニンをリシンに置換した場合　RtoK　のシミュレーション結果のどちらでも裏付けられた。

This picture is corroborated by additional simulations where either phenylalanines were replaced with alanines (FtoA mutant) or arginines with lysines (RtoK mutant).

局所的な密度の比較から、FtoAと RtoKの相互作用はWTよりも著しく弱いことが示唆された。

The comparison of local density distributions suggests that intermolecular interactions between FtoA and RtoK mutant fragments are significantly weaker to those observed in wild-type sequences with the exception of the Frag1 + Frag3 system, where electrostatic interactions are predominant (Figure 3D–F).

計算上の変異導入結果は、FtoA および RtoKがphase separationを減少させることを示す実験と一致した。

The results of our computational mutagenesis are therefore consistent with the experiments(10,14) indicating a decreased phase separation propensity of NDDX4 upon FtoA and RtoK substitutions.

さらに、分子間の残基同士の分子間相互作用の解析は、このような挙動の分子的な決定要因を解読することを助ける。

Furthermore, the analysis of the intermolecular residue–residue contacts helps deciphering the molecular determinants of this behavior.

FtoAの変異体では、アラニンは小さいので、しばしば分子間の相互作用ネットワークで鍵となる役割を果たす大きなフェニルアラニンの代わりになることができない。これはFlag1のシミュレーションでより明確に明らかになった。

In FtoA mutants, small-sized alanines cannot substitute for the larger phenylalanines that often play a key role in the intermolecular interaction network, as particularly evidenced by Frag1 simulations (Figure 3G–I and Figure S9A).

RtoK置換の不安定化効果は、アルギニンと（芳香族や/または平坦な残基）との結合から説明できる。リジンに変えたときはそれらは保存されなかった。

The destabilizing effect of RtoK substitution can instead be explained by the favorable pairing of arginines with aromatic and/or planar residues, which is not preserved upon replacement with lysine (Figure 3J–L and Figure S9B).

驚くべきことに、高濃度の不均一な環境ではこのような異なった動作はFrag2やFrag1+3混合物で見られたような塩橋の効率的な不安定化につながるかもしれない。

Strikingly, in the heterogeneous environment at high concentration, this differential behavior may even result in an effective destabilization of salt bridges as observed for Frag2 and for the Frag1+Frag3 mixture.

芳香族の残基やアルギニンはcation−π 及び π–π相互作用を通してmembraneless organellesを形成するタンパク質のphase behaviorを調整すると仮定されてきた。

Aromatic residues and arginines are assumed to regulate the phase behavior of several MLO forming proteins through cation−π and π–π interactions.(17,21,58,59)

IDPによるLLPSの決定的な役割を果たすにもかかわらず、これらの部分が形成する相互作用の構造的理解は折り畳み構造の解析及びsingle- or two-chain MD simulation「だけ」から得られている。

Despite this critical role in driving LLPS of IDPs, our structural understanding of the interactions formed by these moieties derives exclusively from the analysis of folded structures(25,55,60) or from single- or two-chain MD simulations of protein fragments.(15,24,37)

我々は、LLPSの起こる環境をより忠実に再現した状況下で相互作用を考えるためにアルギニンやフェニルアラニンに富むFrag1のシミュレーションに着目した。

We focused on the simulations of Frag1, which is rich in arginines and phenylalanines, to characterize these interactions in conditions that are more representative of the dynamical and complex environment of condensates.

最初に、フェニルアラニン-フェニルアラニンの結合を、「フェニル基グループのcentroid間の距離Dと、対応する平面の角度θの関数として」free energy surfaceを決定することにより調査した。

We first investigated Phe-Phe binding by determining the free energy surface as a function of the distance D between the centroids of the phenyl groups and the angle ϑ between the corresponding planes (Figure 4A).

結果として得られた光景は思っていたよりも「浅く」、複数の自由エネルギー最小値をもち、それらは同じような深さで、stackedかT-shaped conformationのどちらかに対応している。

The resulting landscape is rather shallow and exhibits multiple free-energy minima with similar depth corresponding either to stacked (ϑ ∼ 0) and T-shaped (60 < ϑ < 90) conformations.

この不均一性は高濃度におけるダイナミックで混雑した環境に起因すると考えられる。

This heterogeneity has to be ascribed to the dynamical and crowded environment observed at high concentration.

２つの独立したフェニルアラニンのシミュレーションはstacked conformationに偏っていて、タンパク質の構造データベースによる分布と一致していることを確かめた。

Indeed, the simulation of two isolated phenylalanines resulted in a free energy surface biased toward stacked conformations (Figure S10), consistent with the distribution in the protein structure database.(55,60)

次に、 Phe-ArgとArg-Argの結合様式を、guanidinium-phenyl と guanidinium-guanidinium groupsの距離及び角度をモニタリングし、free energy landscapesをdistance Dとthe mutual positions ϕの関数としてPhe-Phe, Phe-Arg, and Arg-Arg について表現するすることで解析した。

We then analyzed the Phe-Arg (Figure 4B) and Arg-Arg (Figure 4C) binding modes by monitoring the distance and the angle between guanidinium-phenyl and guanidinium-guanidinium groups, respectively, and evaluated the free energy landscapes as a function of the distance D and the mutual positions ϕ, as described by Marsili et al.(55) for Phe-Phe, Phe-Arg, and Arg-Arg pairs (Figure S11) .

これらの条件全てについて、stacked conformationsはprotein structure databaseで以前に観察された構造的特性と一致して支配的であった。

In all these cases, stacked conformations were found to be largely dominant, in agreement with the conformational propensities previously observed in protein structure database.(55)

全体的に、これらの発見はこのforce fieldが実験で得られた芳香族、平面状、不飽和の側鎖間で形成される結合を（cation−π と π–π相互作用を表現するのに分極、量子的効果を明示的に含めていないのに）再現していると示唆する。

Overall, these findings suggest that this force field effectively reproduces the experimental binding geometries between aromatic and/or planar, unsaturated side chains, even without explicitly including polarization and quantum effects to exhaustively describe cation−π and π–π interactions.

面白いことに、Phe-Phe と Arg-Argのfree energy surfacesでは中間状態において最小値がはっきりとせず、高次構造の存在を示唆している。

Interestingly, both Phe-Phe and Arg-Arg free energy surfaces exhibit less-pronounced minima at intermediate distances (D ∼ 0.75 nm) that are suggestive of higher-order structuring.

次に、複数のフェニルとグアニジウム群により形成されるクラスター構造を調べるために、trajectoriesを解析した。

We thus analyzed our trajectories to probe the formation of clusters composed of multiple interacting phenyl and guanidinium groups.

Figure 4C（4Dの間違い?）では、このような集合体の集団を（二量体から６以上の要素から成る拡張された構造までArg と Pheを分けることで、）特徴付けている

We characterized the population of these assemblies by reporting in Figure 4C the partitioning of Arg and Phe in clusters of diverse sizes, ranging from dimers to extended structures involving more than six members.

全体的に見て、Phe と Arg　の側鎖の相当数（Arg ∼20%, Phe ∼30%）がより高次な相互作用に関わっているとわかった。

Overall, we found that a considerable fraction of Phe and Arg side chains (Arg ∼20%, Phe ∼30%) are involved in high-order interactions (n > 2).

フェニル基とグアニジウム基の三次元の配置の調査はより大きな集合体における様々な相互作用を明らかにした。

The investigation of the three-dimensional arrangements of phenyl and guanidinium groups revealed a variety of interaction patterns in larger assemblies.

ここでは、解析を相当数(Arg ∼10%, Phe ∼16%),得られる三量体に限定して最も多い配置を描画した。

We limit here our analysis to trimeric clusters, which correspond to a considerable fraction of the overall population (Arg ∼10%, Phe ∼16%), and we depict some of their most representative arrangements (Figure 4D).

それらの中では、複数の並行のstackingによるサンドイッチ様の構造が特に多く、交互にArg-Phe-ArgまたはPhe-Arg-Pheのパターンを示した。

Among them, sandwich-like structures based on multiple parallel stacking (Figure 4D, top) are particularly common and most often display alternate Arg-Phe-Arg or Phe-Arg-Phe patterns.

さらに、T-shapede と並行の相互作用を組み合わせたhybrid structureもよく観察された。一方、triangular architecturesはあまり観察されなかった。Single- または two-chain atomistic simulationsはArg-Phe 及び Arg-Tyrの接点をFUS断片でうまく特徴付けたが、LLPSを特徴づけるであろう高次構造の相互作用の証拠は提供しなかった。

Furthermore, hybrid structures combining both T-shaped and parallel interactions (Figure 4D, middle) are frequently observed, whereas triangular architectures (Figure 4D, bottom) are less frequent. Single- and two-chain atomistic simulations were successfully used to characterize Arg-Phe and Arg-Tyr contacts in FUS fragments,(24) but they did not provide evidence for higher-order interactions, which likely represent a peculiar feature of condensed systems involving multiple polypeptides.

驚くべきことに、アルギニンと芳香族の側鎖が交互に（alternate）積み重なった構造的モチーフはタンパク質のfolgdingを熱力学的な安定に大きく寄与し、特に多く見られるわけではないが進化的に保存されていることが知られている、

Remarkably, structural motifs based on multiple, alternate stacking of arginine and aromatic side chains have been shown to greatly contribute to the thermodynamic stability of protein folds and to be conserved by evolution although not particularly common in folded proteins.(61,62)

我々のシミュレーションは高濃度のIDP間においてこの様な相互作用が起こりうることを示している。

Our simulations indicate that dynamical interactions with similar and more complex patterns can frequently occur between IDPs at high concentration.

我々はこの様な複数の側鎖の相互作用が、統計的にアルギニン及び芳香族の残基に富んでいるscaffolding IDPs/IDRsの凝集を促進することによってmembraneless organelles（ MLO）を形成するのに重要な役割を果たしていると仮説を立てる。

We hypothesize that these multiresidue interactions may play an important role in driving the formation of MLOs by promoting the condensation of the scaffolding IDPs/IDRs, which are statistically enriched in arginine and aromatic residues.

Conclusions

原子のMDシミュレーションは構造生物学、分子生物で最も人気の高い手法の一つ

Atomistic MD simulations are currently one of the most popular computational tools in structural biology and molecular biophysics.

にもかかわらずLLPS分野での適用は遅れている

Nevertheless, their application to investigate biomolecular phase separation has lagged behind even if this subject is attracting huge attention in an extremely broad community.

atomistic MD が前例のない高解像度のLLPSにおけるNDDX4の分子相互作用のcharacterizationを提供することがわかった。

Here, we showed that atomistic MD can provide an unprecedented, high-resolution characterization of the molecular interactions underlying the behavior of NDDX4 protein, which represents one of the best-characterized models for cellular LLPS.

大きいサイズのIDPのsingle-molecule simulationsと既存の実験結果の一致はlast-generation force fieldsがcomplex molecular systemsに対して正しいと再確認させる

The agreement between our single-molecule simulations of this large-sized IDP and available experimental results reassures us about the accuracy of last-generation force fields for these complex molecular systems.

さらに分割統治的な手法により現実的な計算量でprotein condensatesをmimickできることがわかった。

Furthermore, the proposed “divide-and-conquer” strategy allowed investigating intermolecular interactions in conditions mimicking protein condensates at an affordable computational cost.

他の分子にも適用可能だろう。

Considering its generality, we are confident that the approach proposed here may be fruitfully extended to characterize other phase-separating IDPs for deciphering the molecular grammar of LLPS with atomistic resolution.

MDsimulationでappropriate enhanced sampling techniquesによってLLPSを予想できる様に成る様注力する。

Our future efforts will be devoted to pushing the predictive capabilities of atomistic MD in this context by appropriate enhanced sampling techniques to further approach the daunting molecular complexity of cellular LLPS.

DEV Community: 1ut

macのPages, Numbers, Keynoteで書式を合わせて貼り付ける方法

Functional insight into Maelstrom in the germline piRNA pathway

Abstract

Background

Results

A conserved MAEL-specific domain and its unique lineage-specific evolutionary expansion and loss

Functional insight from domain architectures

A distant similarity between MAEL domains and the DnaQ-H 3'–5' exonuclease family with the RNase H fold

Structural examinations on active sites by DEDHD and EHHCHC residues in MAEL domains

Discussions and conclusion

Functional insight into MAEL in germline piRNA pathway

MDシミュレーション（Coarse-Grained Model）によるLLPS様の FUS Proteinの凝集体の解析

Abstract

導入

従来の問題点

新規にわかったこと

実験の内容

Introduction

Mac でVim（MacVim）でファイルを開く方法・MacVimをapplication folderに出現させる方法

MacVimをapplication folderに出現させる方法

Macvimのinstall

Macvim.appの位置の確認

/Applicationにsymbolic linkを作成

そしたらこんなふうに出てくる

Mac でVim（MacVim）でfileを開く方法

Crystal Structure and Activity of the Endoribonuclease Domain of the piRNA Pathway Factor Maelstrom

Summary

Introduction

Results

Crystal Structure of the MAEL Domain from D. melanogaster Mael

The MAEL Domain Has Single-Strand-Specific Endoribonuclease Activity

Potential RNA-Binding Residues of the MAEL Domain

The ssRNase Activity of Mael Appears Dispensable for Piwi/Mael-Mediated TE Silencing in Drosophila OSCs

Discussion

MDシミュレーション 用語集

conformational ensemble

MDシミュレーション（Atomistic Simulations）によるLLPSにおける変性タンパク質の相互作用解析

概要

イントロ

メソッド

2.1

2.2

2.4 Analysis of Phe/Arg Side-Chain Interactions

結果とディスカッション

MDシミュレーション　用語集